高效液相色谱蒸发光散射检测法测定乳制品中乳果糖

刘萌萌，宋戈

（东北农业大学国家乳制品质量监督检验中心，哈尔滨150028）

0 引言

乳果糖是牛乳在加热过程中，乳糖在酪蛋白游离氨基的催化下，碱基异构化形成的一种双糖，是判定复原乳的重要指标[1-2]。我国有文件规定凡在产品生产加工过程中使用复原乳的企业必须在其产品包装上醒目标注复原乳以便于消费者作出购买选择[3]。目前,国家农业部颁布检测乳果糖的标准[4]是酶解-分光光度法，对试剂和酶要求高，而文献报道测定乳果糖含量的方法有高效液相色谱示差检测法[5-6]、离子色谱电化学检测法[7-11]和液相色谱串联质谱法[12]，少有高效液相色谱蒸发光散射检测法[13]测定乳制品中乳果糖含量的报道。

本方法针对乳制品，通过调节样品溶液的pH值除去样品中蛋白质，采用氨基色谱柱分离，用蒸发光散射检测器检测，测定乳制品中乳果糖的含量，灵敏度高，准确，简单实用。

1 实验

1.1 仪器设备

Wa ters2695高效液相色谱仪，A lltech2000蒸发光散射检测器,2300TH型超声波振荡仪。

1.2 材料试剂

乳果糖标准溶液(1.000 g/L)，乙腈(色谱纯)，实验用水均为蒸馏水，亚铁氰化钾水溶液（质量浓度为109 g/L），乙酸锌水溶液（219 g/L）；盐酸溶液（浓度为1.0mol/L），氢氧化钠溶液（1.0mol/L），以上试剂除标注的外均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Shodex NH 2P-50色谱柱（250 mm×4.6mm，5μm），柱温为25℃；检测器为蒸发光散射检测器；漂移管温度为90℃；气流量为2.2 L/m in；流动相A为水；流动相B为乙腈；流速为1.0 m L/m in；梯度洗脱程序：0→15m in,10%A线性升至30%A；15→30m in,30%A；30→35m in,30%A匀速降至10%A,保持5m in。

1.3.2 样品处理

液奶和酸奶：准确称量10～20 g到三角瓶中,加入10m L水摇匀。然后用盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节样品溶液的pH值到1.7后，放置一分钟后再调节样品溶液的pH值到4.5，用水转移到50 m L容量瓶中定容摇匀，滤纸过滤后用0.45μm滤膜过滤,供分析测定。

1.3.3 定量测定

标样、样品测定的色谱图如图1所示。图1中，峰1分别为1乳果糖。

图1 乳果糖标准溶液和样品品色谱

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

关于糖类检测，国家检测标准[14-15]推荐的色谱柱是NH2柱，流动相为乙腈与水，比例为70∶30。通过改变乙腈与水的比例发现各种糖的保留时间会发生显著变化，并且随着水的比例的增加而保留时间不断缩短。经过优化通过改变乙腈与水的比例，当以乙腈与水的比例为75∶25等度洗脱时，发现乳果糖和蔗糖二者保留时间接近，无法完全分离。当乙腈与水比例为以80∶20等度洗脱时，这两种物质分离度有所改善。当乙腈与水比例从80∶20渐变到90∶10，发现二者分离效果较好，但乳果糖保留时间过长，导致响应小，灵敏度低，通过尝试乙腈与水比例从90∶10渐变到70∶30，乳果糖、蔗糖和乳糖被洗脱出来，乳果糖与蔗糖达到基本分离，乳果糖响应和灵敏度得到了提高。再维持乙腈与水比例70∶30一段时间，冲洗色谱柱，保证了样品测定的重复性，缩短整体的分离时间。所以在保证各组分良好分离的前提下，加快了乙腈上升的速率，缩短了分析时间，提高了灵敏度，最终的梯度程序为1.3.1节所述。

2.2 检测器参数的确定

载气流速和漂移管温度是蒸发光散射检测器中可以调节的两个重要参数，建立HPLC-ELSD分析方法需要对这两个参数进行优化。在相同的载气流速下，漂移管温度从60℃增加，流动相逐渐得到充分挥发，噪声不断降低，而乳果糖的响应不断增加，当漂移管温度的温度为90℃时信噪比最高，漂移管温度的温度进一步增加，噪声大小基本维持不变，而乳果糖的响应开始大幅度降低，信噪比就降低了如图2（a），所以漂移管温度确定为90℃。在其它条件不变的情况下，载气流速越小，形成的物质粒子半径越大，对激光的散射能力越强，相应的响应信号越大。但并不是载气流速越小越好，因为当载气流速太小时，流动相不能完全挥发，背景噪声会增加，信噪比也会降低。最优载气流速应是在可接受噪音的基础上，产生最大检测响应值时的最低流速。在相同的漂移管温度下，载气流速从1.5 L/m in增加，流动相逐渐得到充分挥发，噪声不断降低，而乳果糖的响应不断增加，当载气流速为2.2 L/m in时信噪比达到最高，载气流速进一步增加，噪声略有降低，而乳果糖的响应开始大幅度下降，信噪比就变小了如图2（b），所以载气流速确定为2.2 L/m in。

图2 OPO信噪比与检测器参数的关系

2.3 样品提取条件的确定

由于乳制品中含有较多的蛋白质和脂肪，如果不除去蛋白和脂肪，不利于提取分离。由于糖易溶于水，用乙腈或乙醇等有机试剂沉淀，加入的量少，沉淀效果不好，加入的量多，会有部分糖析出，都会给出的结果带来影响。加碱或硫酸铜沉淀蛋白，会导致糖类化合物发生化学变化，影响测定结果的准确性。选择国家检测标准[3-4]使用的亚铁氰化钾和乙酸锌作复合沉淀剂，可除去样品中绝大部分蛋白质和脂肪，效果要比加乙腈或乙醇等有机试剂沉淀、加碱或硫酸铜沉淀等其他方法好。但如果亚铁氰化钾和乙酸锌复合沉淀剂加入的少，蛋白沉淀不完全，会给提取和净化带来困难，影响测定，加的过多会造成提取不完全导致被测物的损失，复合沉淀剂的浓度和用量不好控制，此外对色谱柱伤害大，影响色谱柱使用寿命。通过试验，用盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节样品溶液的pH值到1.7后，再调节样品溶液的pH值到4.5，沉淀蛋白效果好，糖类不易析出，提取效果好，没有外加入大量的盐有利于蒸发光散射检测器检测，回收率较好，准确度较高。

2.4 标准曲线和检出限

散射光的响应值与粒子质量的关系为I＝kmb，m表示待测组分的粒子质量和，I表示待测组分所产生的散射光光强，k,b为常数。通过使用双对数方法产生线性曲线,即对待测组分的浓度和响应同时取对数,得到线性方程lg I＝b lg m＋lg k。分别配制不同浓度的标准混合溶液，在最佳色谱条件下，进行了标准曲线的测定，得到乳果糖的回归方程及线性相关系数、线性范围，并以3倍信噪比时的进样浓度计算出了方法的检出限如表1所示。

表1 乳果糖的标准曲线、相关系数以及线性范围和检出限

2.5 回收率

以同一个液奶样品为实验材料，加入一定量的标准样品溶液,进行加标实验，平行测定3次，以平均测定值计算回收率，结果如表2所示。

2.6 方法的精密度

以4个样品为实验材料，称取样品后进行平行8次重复性实验,计算测定值的相对标准偏差(RSD)。样品中乳果糖含量和测定结果的RSD如表3所示。由此可以看出，测定结果的较为稳定，方法的重复性较好。

表2 乳果糖的回收率（n=3）

表3 实际样品中乳果糖测定的精密度率（n=8）

3 结 论

本文重点研究了样品的提取条件、色谱分离条件和检测参数的设定，建立了高效液相色谱-蒸发光散射检测测定乳制品中乳果糖的方法。该方法测定结果重现性好，准确度高，简单易操作，适合乳制品中乳果糖的日常监测，可用于复原乳的鉴定检测。

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