HPLC-ELSD测定婴幼儿配方乳粉中低聚果糖总量

张书芬，毕晓丽，应璐，周子焱，邢家溧，满正印，沈坚

（宁波市食品检验检测研究院，浙江宁波 315040）

0 引言

低聚果糖是一种天然活性物质，具有调节肠道菌群，增殖双歧杆菌，促进钙吸收，调节免疫，抗龋齿等功能[1]。同时，GB 14880-2012[2]中也明确规定了其在婴幼儿配方食品中使用的最大限量不超过64.5 g/kg。

目前，低聚果糖检测方法的研究主要集中在液相色谱和离子色谱上[3-14]。其大多以蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖为目标物，外标法进行定量。这种方法仅适用于检测产品中添加了以蔗糖为原料，利用果糖基转移酶的催化作用转化而成的低聚果糖的检测。而不适用于以菊苣或菊芋为原料，经酶解或酸解而生成的聚合度为2～9的低聚果糖的检测[15]。2017年新实施的国标GB 5009.255-2016[5]的检测方法虽然能检测低聚果糖的总量，但该方法需要配有三元及以上梯度泵,脉冲安培检测器的离子色谱仪，设备价格昂贵，且专用性强，所以不适于推广。本文在参考AOAC 997.08[16]及国标中酶解法原理的基础上，建立了一种对婴幼儿配方乳粉中低聚果糖总量进行检测的实用方法。

1 实 验

1.1 主要仪器

安捷伦1260液相色谱仪（具有蒸发光散射检测器）；艾卡涡旋振荡器；德国优莱博恒温水浴摇床；Therm o离心机。

1.2 材料

1.2.1 试剂

果糖标准物质（纯度≥99.0%），果聚糖酶（外切酶活力20 000 U）；蔗糖酶（酶活力300 U），乙腈为色谱纯，实验室用水为超纯水；氢氧化钠、马来酸钠、乙酸、硼氢化钠等其他试剂均为分析纯。

1.2.2 试剂的配制

(1)硼氢化钠溶液(质量浓度10m g/m L):准确称取适量硼氢化钠(精确至0.001 g)于聚丙烯离心管中,用浓度为50mm ol/L氢氧化钠溶液溶解,用时现配。

(2)蔗糖酶溶液(5.0 U/m L)∶将蔗糖酶(活力为300 U)溶解于60m L马来酸钠缓冲溶液(浓度100mm ol/L,pH=6.5)中,分装到2m L的离心管中,-20℃保存,可放置6个月。

（3）乙酸钠缓冲溶液(pH=4.5)∶吸取14 m L乙酸溶液(浓度为200 mm o l/L)和11 m L乙酸钠溶液(200 mm ol/L)混合,并用水稀释至50m L,用时现配。

（4）果聚糖酶溶液(500 U/m L)∶将果聚糖酶(活力为20 000 U)溶解于40 m L乙酸钠缓冲溶液,分装到2 m L的离心管中,-20℃保存,可放置6个月。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Carbohydrate糖分析专用柱（250 mm×4.6 mm,5μm），流动相（乙腈∶水=85∶15），流速为1.0 m L/m in， 进样体积为20μL，柱温为40℃。

检测器条件:雾化温度为85℃，雾化器流量为1.6 m L/m in，增益为8.0。

1.3.2 样品前处理

准确称取5 g左右试样于锥形瓶中,加入80℃热水约30m L,置于80℃±1℃恒温水浴摇床中,150 r/m in振摇15 m in后,冷至室温转移定容至50 m L容量瓶中，过滤或离心备用。根据样品中低聚果糖的具体含量和标准曲线的线性范围确定稀释倍数。

若样品中含有蔗糖，取上述样液300μL于10m L具塞玻璃试管中,按每毫克蔗糖加入125μL蔗糖酶溶液(5.0 U/m L)加入蔗糖酶溶液,旋涡振荡混匀,置于40℃±1℃恒温水浴摇中,150 r/m in振摇60 m in后,加入300μL硼氢化钠溶液,继续振摇30 m in后,取出,冷却至室温后加入750μL乙酸溶液,静置10m in。按每毫克低聚果糖加入250μL果聚糖酶溶液(500 U/m L)加入果聚糖酶溶液,旋涡振荡混匀,于上述同样条件下振摇30 m in冷却至室温后定容至2.5 m L，过0.22μm水相滤膜上机待测。若样品中不含蔗糖，取上述样液300μL于10m L具塞玻璃试管中，直接加入果聚糖酶进行实验。

2 结果与讨论

2.1 酶解条件的优化

前处理过程蔗糖酶用来酶解样品中蔗糖使其水解成果糖和葡萄糖，生成的葡萄糖和果糖经硼氢化钠还原成相应的糖醇，而样品中的低聚果糖不受酶解和还原影响，样品中的低聚果糖经过果聚糖酶水解成果糖和葡萄糖,经HPLC-ELSD测定果糖含量,通过折算得到果聚糖的含量。由于果聚糖酶也能够一定程度上水解蔗糖，所以如果蔗糖水解不完全，将会影响检测结果，使检测数据偏高。果聚糖酶如果添加不够，水解不完全，将使低聚果糖不能完全被检测到，从而使检测结果偏低，所以酶解条件的优化十分重要。

在300μL样品稀释液中添加1 m g蔗糖，加入不同量的蔗糖酶进行酶解，通过测定生成的果糖含量的变化来确定每毫克蔗糖需要的蔗糖酶的量。同理，对每毫克低聚果糖需要的果聚糖酶量进行考察。实验结果如图1所示。从图中可以看出，每毫克蔗糖中加入125μL蔗糖酶，每毫克低聚果糖中加入250μL果聚糖酶可以达到完全酶解的效果。

赵丹霞[17]等人的研究表明，婴儿奶粉一般不添加蔗糖，较大婴幼儿奶粉中一般不超过10 g/100 g。低聚果糖添加量一般为1～3 g/100 g之间，GB14880-2012规定低聚果糖与低聚半乳糖等添加总量不超过6.45 g/100 g。按照实验考察出的酶的酶解能力计算，在婴幼儿配方乳粉中蔗糖酶的添加量一般不超过375μL，果聚糖酶的添加量一般不超过500μL。

图1 蔗糖酶和低聚果糖酶加入量对果糖检测结果的影响

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 色谱柱及的流动相比例的优化

果糖、葡萄糖等糖类一般选用氨基柱进行检测。本文分别采用氨基柱和ZORBAX Carbohydrate糖分析专用柱进行了比较。实验表明，两根色谱柱都能对果糖、与葡萄糖和糖醇进行分离，但都不能将葡萄糖和糖醇分离，由于实验中是通过测定果糖含量后，通过折算来测定低聚果糖总量，所以从分离角度，两根色谱柱都能满足分离要求。但相同测定条件下，氨基柱基线噪音明显高于糖分析专用柱，这可能是由于糖分析专用柱是在氨基柱的基础上添加了乙酰基，使柱流失减小的缘故，故本文选用ZORBAX Carbohydrate糖分析专用柱作为测试柱。

蒸发光检测器的检测原理决定其需使用易挥发的流动相，一般不添加无机盐。本文选用水和乙腈作为流动相。在本文色谱条件下，通过考察各组分的分离程度、果糖的峰形、基线噪音三方面来优化流动相比例。试验考察了四组乙腈与水不同比例的情况，具体效果如图2所示。

图2 不同流动相比例的色谱

由图2可以看出，随着流动相中水相比例降低，仪器的基线噪音越低，并且果糖与葡萄糖和糖醇的分离度更好，但同时色谱峰延展变宽，且随着水相的比例增加响应值变低。为了保证良好的分离度、峰形和较低的基线噪音，本研究选择乙睛∶水为85∶15的流动相比例。

2.2.1 蒸发光检测器雾化气流量的选择

作为通用型检测器，蒸发光检测器其响应不依赖于样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品经雾化蒸发后得到的颗粒散射光后均能被检测。雾化气流小，可以形成较大的雾滴，有利于散射光的增强，目标物响应增强。但雾化气流过小会使流动相挥发不完全，背景、基线增高，污染检测器。所以试验中分别选取1.4,1.6，1.8，2.0 m L/m in雾化气流量进行了优化。实验结果表明当雾化气流量为1.6 m L/m in时，在背景干扰、基线噪音和响应之间达到了一个比较好的平衡。

2.3 检测结果的折算

试验中直接测定结果为果糖含量，折算成低聚果糖采用GB5009.255-2016中的计算公式，低聚果糖聚合度以4计。

2.4 标准曲线、检出限和定量限

用纯水配制20，50，80，100，1500，300 m g/L质量浓度的果糖标准系列溶液，在选定的色谱条件下上机，获得幂函数方程为y=35.46120x1.08788（其中y为峰面积，x为果糖质量浓度），相关系数r=0.99957。

另外，还考察了方法的检出限和定量限，当信噪比（S/N）为3时，果糖的上机检出限为10 m g/L，折算成低聚果糖的检出限为1.0 g/kg，低聚果糖的定量限为3.0 g/kg。

2.5 精密度和回收率

在未添加低聚果糖的婴幼儿配方乳粉样品中添加定量限、5倍定量限和国标限量水平质量分数的标样，按选定试验方法进行加标回收实验，每个加标样品平行测定6次，结果如表1所示。

2.6 样品分析与国标对比

对标签中明示添加了低聚果糖的5批婴幼儿配方乳粉进行测试，并外送样品按照GB5009.255-2016标准进行检测，本方法与国标方法比较结果如表2所示。

表1 低聚果糖在婴幼儿配方乳粉中的回收率和精密度

表2 本文方法和国标方法测定结果比较

3 结 论

通过酶加入量、色谱柱、流动相比例、雾化气流量等条件的优化，首次建立了一种高效液相色谱蒸发光检测器测定婴幼儿配方乳粉中低聚果糖总量的方法。该法准确可靠，三水平加标回收率均在86.7%～105.1%之间。检测结果与国标法具有一致性，5批次实际样品检测结果和国标方法对比，绝对偏差均小于8%。由于该法使用仪器设备价格低，实验室基本配备，比国标方法更具有实际应用和推广价值。为低聚果糖的检测及推广应用提供一定的参考，为营养标签的规范标识提供技术支持。

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