群体感应信号分子存在下磺胺对大肠杆菌生长、突变及R388质粒接合转移的影响

王雅娟，马清萍，于洋，宋春磊，程逸飞，史珺怡，林志芬,*

1. 同济大学环境科学与工程学院，污染控制与资源化研究国家重点实验室, 上海 200092 2. 上海市化学品分析、风险评估与控制重点实验室, 上海 200092 3. 上海污染控制与生态安全研究院, 上海 200092 4. 上海海洋大学海洋生态与环境学院, 上海 2013062 5. 环境保护部固体废物与化学品管理技术中心, 北京 100029 6. 桂林理工大学环境科学与工程学院, 桂林 541004

抗生素具有强大的抗菌能力，在医学领域、禽畜业和水产养殖等行业均被大量投入使用，2013年我国抗生素的年使用量达16.2万吨[1]。但是，随着抗生素的广泛使用甚至滥用，细菌耐药性问题受到了越来越多的关注。细菌耐药性形成和传播的重要条件之一是抗生素抗性基因(antibiotics resistance genes, ARGs)的获得[2-3]，主要有2种方式：一是在长期的抗生素选择压力下细菌自身发生基因突变，从而产生抗药性，虽然基因自发突变率只有10-8～10-6[4]，但是微生物增殖快、体积小、分布广的特性放大了细菌基因突变的作用；二是细菌通过基因水平转移获得外源性抗性基因，耐药基因水平转移是指基因跨越细菌间的种属屏障，在种内不同个体之间、种间甚至是属间进行转移，是细菌在开放的环境中获得抗性基因的重要途径[3]，包括转化、转导、接合转移3种方式[5]。其中，接合转移是环境中基因水平转移最普遍、最有效的1种方式，是以质粒作为抗性基因载体，通过细胞之间的接触发生DNA转移的抗性基因传播方式[6-7]。细菌耐药性将会给许多疾病的预防和控制增加难度并对人类健康产生威胁，其产生和传播规律是亟待明确的问题。

为了解决细菌耐药性问题，许多研究围绕抗性基因展开，发现其形成与传播跟群体感应(quorum sensing, QS)相关。群体感应系统是一种全局性的调控系统，参与调控多种细菌的多项生命活动，密度依赖型的生命活动多与该系统有关。Krašovec等[8]研究发现，大肠杆菌(Escherichia coli )能够通过AI-2种间群体感应系统改变利福平耐药突变率；Qiu等[9]和Chatterjee等[10]研究发现，菌体密度越高，越有利于接合转移的发生。因此，基于群体感应系统对基因突变、接合转移的影响研究可能是未来探究细菌耐药性产生和传播规律的一个新思路。

磺胺类抗生素(SAs)因其价格低、抗菌谱广、易储存等优点被广泛使用。有关SAs的生物毒性研究大多围绕单一及联合毒性展开，关于其对生长、基因突变和接合转移效应与群体感应系统之间的联系的研究尚少。有研究表明，角蒽环抗生素能够作为种间信号分子通过群体感应系统调节天蓝色链霉菌的一系列生理行为[11]。那么，群体感应信号分子是否会影响SAs对大肠杆菌的生长、突变和接合转移？

本文选取大肠杆菌为模式生物，探究了群体感应信号分子N-(β-酮己酰)-L-高丝氨酸内酯(3-oxo-C6-HSL, C6)与SAs对大肠杆菌的联合毒性效应、突变效应和接合转移效应。该研究有助于更准确全面的认识SAs对大肠杆菌的生长效应、突变效应、接合转移效应与种内群体感应系统之间的关系，为探究大肠杆菌耐药性的产生与传播提供新思路。

1　材料与方法(Materials and methods)

1.1　试剂与仪器

实验中的大肠杆菌 MG1655菌株购买于北京谱如汀生物技术有限公司，IncW抗性质粒R388购于普如汀生物技术有限公司。C6购于cayman化合制品有限公司(USA)，其他化合物均购于Sigma-Aldrich 化学制品有限公司(上海)，纯度均≥99%，试剂信息见表1。

1.2　工作菌液的制备

将R388质粒供体菌和有萘啶酮酸抗性标记的受体菌分别接种于含有25 mg·L-1卡那霉素和25 mg·L-1萘啶酮酸的LB液体培养基中，在37 ℃摇床中以180 r·min-1的转速震荡培养至对数生长期(6 h)，将培养的菌液离心去上清液后加入1% NaCl至原体积，震荡重新悬浮。用1% NaCl溶液调节菌液OD600为0.5，再将受体菌和R388供体菌以10：1的比例混匀即为工作菌液。

1.3　暴露实验

采用微量肉汤稀释法对受试抗生素进行暴露实验，37 ℃、180 r·min-1的条件下培养12 h至稳定期。

生长量测定：使用全波长酶标仪(Multiskan GO，美国赛默飞世尔科技公司)测得OD600用于表征细菌生长量。

突变子数测定：使用40 mg·L-1利福平筛选平板筛选稳定期突变菌，37 ℃恒温培养箱中静置培养12 h后对菌落计数。

受体菌和接合子的测定：暴露结束后，对体系进行适当稀释，用含抗生素的筛选平板筛选抗性菌，其中，受体菌的筛选平板含40 mg·L-1萘啶酮酸，R388接合子的筛选平板含40 mg·L-1萘啶酮酸、40 mg·L-1甲氧苄啶和40 mg·L-1磺胺甲恶唑。将筛选平板置于37 ℃培养箱中静止培养12 h后对菌落计数。

1.4　数据表征

MM法(MSS maximum likelihood)用于计算突变率时，不仅计算结果重复性较好，而且可直接估算突变率，适用于传统统计学[12-14]。本文选择MM法，将不同浓度受试化合物染毒下对应的突变子数换算为突变次数。化合物对大肠杆菌的生长效应和突变效应均用促进率表示，计算如公式(1)所示：

(1)

式中，P 表示生长量促进率或突变促进率，f0、fi分别表示对照组、第i个测试样的OD600值或突变次数。

化合物对大肠杆菌的质粒接合转移效应用抑制率表示，计算如公式(2)所示：

(2)

式中，P 表示接合转移抑制率，f0、 fi分别表示对照组、第i个测试样的接合子数。

表1　受试化合物基本信息Table 1　 Information of reagents used in the experiment

本文使用Weibull函数[15]和biphasic函数[16]进行曲线拟合并作图，如公式(3)和(4)所示。

Pc= pmax-(pmax-p0)× exp (-(m×c )n)

(3)

式中，pmax、p0、m 及n 分别为拟合参数，其中pmax表征剂量效应曲线最高剂量的抑制率pc；p0表示浓度c 为0时的抑制率pc，本实验中设置为0。

(4)

式中，因pmin1和pmin2在本文已知，故将其分别设置为常数0和-100，pmax、c1、c2、h1、h2均作为参数参与拟合。

2　结果与讨论(Results and discussion)

2.1　C6存在下SCP对大肠杆菌生长的影响

本文测定了不同浓度的C6存在下SCP对大肠杆菌生长的影响，结果如图1所示。

由图1可知，SCP作用于大肠杆菌时，对细菌生长有抑制作用，且剂量-效应曲线呈经典S型，EC50为2.63E-6 mol·L-1。为了探究群体感应信号分子是否影响SCP对大肠杆菌的毒性，本文在梯度浓度SCP的基础上分别加入等浓度的C6，结果发现SCP分别与2 μmol·L-1、20 μmol·L-1、200 μmol·L-1、2 000 μmol·L-1的C6 联合作用时的EC50分别为：2.03E-6 mol·L-1、2.91E-6 mol·L-1、3.92E-6 mol·L-1、2.73E-6 mol·L-1，可见，C6不影响SCP对大肠杆菌的毒性效应。研究表明，群体感应系统可以调控细菌毒力因子的表达、固氮基因、Ti质粒的接合转移、抗生素的产生、细菌群游与生物被膜的形成、生物发光等，不影响细菌的生长繁殖[17]。所以，本文推测SAs对大肠杆菌的生长毒性与群体感应系统无关。那么，群体感应系统是否会影响基因突变和接合转移?

2.2　C6存在下SAs对大肠杆菌突变的影响

有文献指出1 μmol·L-1和25 μmol·L-1的C6能够调节费氏弧菌的群体感应系统[18]，实际检测发现菌落中的群体感应信号分子的浓度大多不超过40 μmol·L-1[19]。因此，本文选择20 μmol·L-1的C6，测定了其存在下SCP对大肠杆菌突变的影响，此外，本文以SMX、SPY为研究对象对所得结果加以验证，结果如图2所示。

由图2可知，3种SAs对大肠杆菌突变率均有显著的促进作用，效应曲线呈倒U型，单一作用时SCP、SMX、SPY的最大促进率分别为196.30%、100.88%、117.01%。有文章指出，真空干燥引起的应激反应(SOS反应)是离子注入的真空干燥条件诱发大肠杆菌突变的主要原因之一[20]，并且SOS反应能够被环丙沙星、利福平、β-内酰胺、甲氧苄胺嘧啶等抗生素激活[21]。本文猜测，SAs也能够通过引起SOS反应而导致大肠杆菌突变，而药物浓度增大会引发更为剧烈的SOS反应，细菌发生SOS反应时出现错误修复的次数增多，基因突变率随之增大。

C6与SAs联合作用对大肠杆菌突变率同样有显著的促进效应，相比SAs单一作用时促进作用较小，与C6联合作用时SCP、SMX、SPY的最大促进率分别为155.35%、64.76%、89.93%。这说明C6能够削弱SAs对大肠杆菌突变的促进作用。有研究表明群体感应能够调控细菌外排泵基因的表达[22-23]， Rahmati等[24]发现SdiA蛋白能够正向调控大肠杆菌多药外排泵AcrAB-TolC系统中AcrAB蛋白的表达，而大肠杆菌的SdiA蛋白属于LuxR家族，C6与SdiA蛋白结合可能进一步激活群体感应系统，增强大肠杆菌外排泵基因的表达，大肠杆菌将SAs泵出(如图3所示)，从而削弱SAs引起的SOS反应，降低SAs对大肠杆菌的突变促进作用。

图1　不同浓度N-(β-酮己酰)-L-高丝氨酸内酯(C6)存在下SCP对大肠杆菌生长的影响Fig. 1　Effect of SCP on growth of Escherichia coli in the presence of 3-oxo-C6-HSL (C6) with different concentrations

2.3　C6存在下SAs对大肠杆菌接合转移的影响

为了进一步探究群体感应信号分子对抗生素抗性基因传播的影响，本文测定了20 μmol·L-1C6存在下SCP对R388质粒在大肠杆菌种属内接合转移的影响，此外，本文以SMX、SPY为研究对象对所得结果加以验证，结果如图4所示。

由图4可知，3种SAs对大肠杆菌R388质粒的接合转移均有显著的抑制作用，效应曲线呈S型，单一作用时SCP、SMX、SPY的20%促进率对应的浓度分别为3.48E-6 mol·L-1、7.05E-6 mol·L-1、8.76E-5 mol·L-1。接合转移是一个复杂的生理过程，其发生的必要条件是供体菌与受体菌之间的物理接触，而低浓度抗生素会削弱鞭毛介导的泳动能力[25]，所以推测SAs能够降低大肠杆菌的泳动能力，导致细胞相互接触的几率减少，从而抑制接合转移的发生。

图2　C6存在下SAs对大肠杆菌突变率的影响Fig. 2　Effect of sulfonamides on mutation ratio of Escherichia coli in the presence of C6

图3　C6与SdiA蛋白作用模式示意图Fig. 3　The schematic of the mode of action between C6 and SdiA

图4　C6存在下SAs对R388质粒接合转移的影响Fig. 4　Effect of sulfonamides on conjugal transfer of plasmid R388 of Escherichia coli in the presence of C6

C6与SAs联合作用对大肠杆菌R388质粒接合转移同样有显著的抑制效应，且比SAs单一作用时的抑制作用大，与C6联合作用时SCP、SMX、SPY的20%促进率对应的浓度分别为2.52E-6 mol·L-1、1.10E-5 mol·L-1、2.13E-5 mol·L-1。可见C6能够增强SAs对大肠杆菌R388质粒接合转移的抑制作用。接合转移需要一系列酶的参与：DNA在解旋酶的切割作用下产生缺口并复制一条单链DNA，该单链DNA通过“接合桥”进入受体菌内[26]，受体菌的限制修饰系统能够识别并降解外源DNA，如果进入受体菌内的单链DNA未被识别降解，就会形成完整的环状双链质粒，则接合转移成功。本文猜测C6对大肠杆菌R388质粒接合转移的影响可能是通过参与调控限制修饰系统，使得转移到受体菌内的单链DNA容易被识别降解，无法形成完整的环状双链质粒，从而降低质粒接合转移频率。

综上可知：

1)C6不影响SAs对大肠杆菌的毒性效应，推测SAs对大肠杆菌的生长毒性与群体感应系统无关。

2)C6能够削弱SAs对大肠杆菌突变的促进作用，推测群体感应系统能够通过调控外排泵基因的表达，将SAs泵出细菌外以削弱SAs引起的应激反应，从而降低突变促进作用。

3)C6能够增强SAs对大肠杆菌R388质粒接合转移的抑制作用，推测群体感应系统可能是通过参与调控限制修饰系统发挥作用。

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