纳米银的体内毒性及毒作用机制研究进展

王秀娟，薛玉英,* ,唐萌

1. 环境医学工程教育部重点实验室，南京 210009 2. 东南大学公共卫生学院&苏州纳米科技协同创新中心，南京 210009 3. 江苏省生物材料与器件重点实验室，南京 210009

纳米材料是指在三维尺度上至少有一维尺度小于100 nm的物质[1]。随着纳米技术的飞速发展，越来越多的纳米材料开始应用于食品、药品、电子、包装、化工等领域。纳米产品层出不穷，给人们的生活带来了极大的便利，与此同时，纳米物质与人体接触的机会也随之增加，其安全性问题逐渐引起广泛关注。

纳米银是以纳米技术为基础研制而成的新型纳米材料，具有比表面积大、尺寸小、强表面活性、强催化性能等特点，被广泛应用于医疗、食品、陶瓷、光学、纺织、化妆品、催化剂、半导体材料、低温导热材料、水质净化等方面[2]。银有很长的应用历史，在古代用银做器皿、头饰，含银的敷料用于治疗烧烫伤，此外，银还能够用于外科手术，银的这些广泛应用主要利用其优良的抗菌特性。与普通银相比，纳米银的抗菌特性更强，因而应用范围更加广泛。当今社会，由于抗生素的滥用使动物产生了很强的耐药性，纳米银常被添加到饲料中来代替抗生素[3]；纳米银凝胶制剂可用于治疗宫颈炎、宫颈糜烂等妇科疾病；一些空气清新剂中加入纳米银以提高使用效果。越来越多的含纳米银产品走进人们的日常生活中，使人体在不知不觉中接触到纳米银，然而，人们对于纳米银的毒作用、其毒作用的影响因素、作用机制的了解却少之又少。因此，本文结合以往的研究对以上问题进行阐述，以求增强人们对纳米银的认识，希望可以为纳米银的应用带来更多的启示和警醒。

1　纳米银的暴露及体内分布(Exposure and biodistribution of silver nanoparticles)

人类接触纳米银的途径有很多，其中最常见的接触方式有呼吸系统接触、消化道接触、以及皮肤接触，暴露途径不同，使其在机体内的分布情况不同，对人体健康的影响也有所差异。大量研究表明，机体经呼吸道暴露于纳米银后，纳米银主要蓄积在肺部，并对肺造成一定的不良影响。Davenport等[4]用纳米银对小鼠进行吸入染毒，结果发现纳米银主要集中在肝、脑及肠道相关淋巴组织中，该试验表明虽然呼吸道暴露后肺通常是主要靶器官，但是由于纳米粒子极小很容易被转运到其他组织或器官中。纳米银经口进入机体是最为常见的一种暴露途径，经口暴露的纳米银主要分布于胃肠道、肝脏、肾脏和脾脏；除此之外，有研究证明经口暴露的纳米银还可通过血脑屏障到达大脑，并在脑中蓄积[5]。皮肤作为人体最大的防御器官，当皮肤破损或机体抵抗能力下降时，外来物质可穿透皮肤进入机体。有研究表明，纳米银具有穿透完整皮肤的能力，分布于表皮和真皮层[6]。此外，真皮中的纳米银还可以通过皮下淋巴系统到达全身。Tang等[7]对大鼠皮下注射50～100 nm的纳米银，发现纳米银颗粒可进入血液循环，主要分布到肾脏、肝脏、脾脏、大脑和肺中。任何一种物质的毒性都源于它的生物可渗透性，纳米银亦是如此；作为一种应用十分广泛的纳米材料，纳米银在给人类创造价值的同时，其广泛的暴露途径也增加了对人类健康的危害。

2　纳米银的体内毒性(The interal toxicity of silver nanoparticles)

为了研究纳米银的体内毒性，常采用灌胃、吸入、气管滴注、皮下注射或静脉注射等方式进行动物试验。表1简单归纳了纳米银对各个系统的毒性研究。

2.1　对消化系统的毒性

纳米银以其独特的抗菌特性被广泛应用于各种日常用品和包装材料中。作为食品添加剂，它可以防止果汁结块而保持澄清；纳米银包装材料与普通包装材料相比具有更好的机械性能、热力学性能、阻隔性能以及抗菌性能。食物中的纳米银可以被消化道摄入，包装材料中的纳米银也可以缓慢地释放到食物中进而被人体吸收，消费者很可能在毫无察觉的情况下接触到纳米银，因此建立纳米银对于人体的健康危险度评价显得尤为重要。

普遍认为，纳米银的吸收速率随着粒径的减小而增大[8]。经呼吸道吸入的纳米颗粒也可以通过粘液纤毛运动再吞咽至胃肠道内[9]。Walczak等[10]用60 nm的纳米银和银离子(硝酸银)利用人体消化道的体外模型进行试验，结果显示经过唾液和胃的消化，纳米银数量显著下降，经肠道消化后又回到原始值。起初纳米银颗粒的减少由其聚集造成，这些聚集体由纳米银和氯元素组成，而在肠消化过程中，这些聚集体又重新解体回到游离的纳米银颗粒状态，因此纳米银可以在其原始浓度上到达肠壁。一旦被肠粘膜吸收，纳米银靶向到达肝。Ebabe Elle等[11]在一个81 d喂养试验中发现，纳米银(20 nm)可引起大鼠肝中低密度脂蛋白、肿瘤坏死因子、白细胞介素-6水平增加，血浆丙氨酸转氨酶活性增加，对氧磷酶活性下降，肝发生炎症，肝功能异常。Kim等[12]在对F344大鼠经口喂养纳米银(56 nm)的90 d研究中发现，纳米银可导致大鼠胆管增生，肝小叶的嗜酸性粒细胞浸润，碱性磷酸酶活性增强，淋巴中的B细胞和IgE含量增加。由此，可证明纳米银具有肝毒性。Qin等[13]用PVP包被的纳米银和硝酸银(Ag+)以0.5 mg·kg-1和1.0 mg·kg-1的剂量对100只雄鼠和雌鼠口服喂养28 d，结果发现AgNPs组和AgNO3组在动物体重、器官重量、摄食量以及组织病理学检查中均无明显差异，肝和肾为主要靶器官，其次为睾丸和脾，器官中的Ag含量检测发现AgNPs组低于AgNO3组，血生化指标明显异常。该试验表明无论是纳米银还是Ag+均会对机体产生毒性作用。

2.2　对呼吸系统的毒性

由于纳米银粒径极小,因此很容易通过简单扩散的形式经过肺泡进入体内，一般而言，粒径越小进入呼吸道的部位越深。纳米银进入体内后，其转移途径主要有5种：经呼气再次排出体外、穿过肺泡进入血液循环、迁移至淋巴循环、被肺泡巨噬细胞吞噬、沉积在肺泡上皮细胞中。肺组织中沉积的纳米银,可引发肺部炎症。在一个亚慢性纳米银吸入毒性研究中，Sung等[14]给8周大的Sprague-Dawley大鼠(雌雄各半)吸入性染毒粒径为18～19 nm的纳米银90 d后，结果显示雌鼠和雄鼠体内均出现剂量依赖性的胆管增生，肺功能下降，肺组织有不同程度的炎细胞浸润，肺泡壁增厚以及小的肉芽肿样病变。Hyun等[15]用13～15 nm的纳米银对6周大的Sprague-Dawley大鼠进行重复鼻粘膜染毒，28 d后发现与对照组和低剂量组相比高剂量组中含黏液素的杯状细胞体积和数量显著增加，黏液素中硫黏蛋白含量轻微上升，而唾液粘蛋白未出现显著变化，该试验尽管观察到了纳米银对黏膜黏液素的影响，但不足以说明纳米银具有毒性效应；鉴于黏液素在呼吸系统健康和宿主抵抗力中的重要作用，因此需要更多的研究进一步证实。Silva等[16]用20 nm和110 nm的纳米银对大鼠进行雾化吸入染毒，并分别在第1、7、21、56天检测支气管肺泡灌洗液(BALF)及肺组织，结果显示BALF中细胞总数、蛋白质、乳酸脱氢酶含量在第7天显著增加，并伴随显著的细胞毒性反应，组织病理学检查显示肺部发生炎症，并达到峰值；第21天检测到20 nm纳米银组多形核细胞数量多于110 nm纳米银组，组织炎症较110 nm纳米银组严重；第56天炎症反应消失。该研究表明，吸入染毒纳米银可导致肺部发生迟缓性、短暂性的炎症反应和细胞毒性，且粒径较小的纳米银引起的毒性反应更加强烈。

2.3　对神经系统的毒性

许多研究证实沉积在鼻粘膜上的纳米颗粒可通过嗅觉神经到达脑组织，而纳米银对神经系统的损伤与纳米银的粒径密切相关，一般而言粒径越小毒性越大。有报道指出到达脑组织的纳米银可导致神经递质多巴胺耗竭及细胞毒性。Lee等[17]进行的大鼠吸入染毒纳米银14 d研究发现纳米银影响脑内细胞的基因表达，其中大脑中有468对基因，小脑中有952对基因的表达改变是由纳米银引起的；纳米银引起的基因表达改变与运动神经元紊乱、神经退行性疾病、免疫细胞功能下降有关，表明纳米银有潜在的神经毒性和免疫毒性。Rahman等[18]为研究纳米银对小鼠不同脑区基因表达的影响，分别以0 mg·kg-1、100 mg·kg-1、500 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1的纳米银(25 nm)对小鼠进行腹腔注射，24 h后，迅速从大脑取出尾状核、额叶皮质和海马，对这3个区域的RNA分离提取，实时RT-PCR分析采用小鼠氧化应激和抗氧化的阵列，阵列数据显示尾状核、额叶皮质和海马这3个区域的基因表达不同，这个研究结果表明纳米粒子(25 nm)可能通过产生自由基引起的氧化应激，改变基因表达，导致细胞凋亡。Liu等[19]给成年雄性Wistar大鼠鼻腔染毒纳米银14 d后进行长时程增强(LTP)记录、Morris水迷宫(MWM)试验并在海马匀浆中进行ROS的检测；结果显示，与对照组相比低剂量组和高剂量组LTP和记忆异常，海马匀浆中ROS的数量明显增多。该研究表明纳米银可造成神经损伤。目前，关于纳米银对神经系统毒性研究还不是很多，且动物试验外推到人时也有一定的局限性，因此，关于纳米银的神经毒性有待进一步探索。

2.4　对生殖系统的毒性

纳米银凝胶常用于治疗宫颈炎、宫颈糜烂等女性疾病，从而使女性生殖道与纳米银直接接触，那么，纳米银是否会对女性生殖系统带来不良影响，迫切需要毒理学研究进行验证。徐丽明等[20]通过对家兔阴道连续给药6 d的试验研究，发现纳米银可在不同的生殖器官组织内蓄积，阴道黏膜组织、子宫内膜组织乃至卵巢组织出现程度不同的超微病理变化，诸如线粒体肿胀、内质网扩张、空泡形成等。Melnik等[21]用放射性同位素Ag-110m标记的且被PVP包被的纳米银对孕鼠(孕第12天)和哺乳期雌鼠(哺乳第14～16天)以1.69～2.21 mg·kg-1的剂量进行灌胃，在灌胃后24 h和48 h用低背景γ谱仪检测胎鼠和幼鼠体内的纳米银含量，结果显示48 h到达胎儿体内的纳米银含量为给药剂量的0.085%～0.147%，这与到达母体肝、血液、肌肉中的纳米银含量近似，说明纳米银可通过胎盘屏障；在48 h时检测到乳汁中纳米银含量为给药剂量的1.94%±0.29%，且乳汁中超过25%的纳米银会被幼鼠吸收，说明纳米银经乳汁传递给子代。Charehsaz等[22]对怀孕的SD大鼠在其怀孕的第7到第20天，每天分别以0、0.2、2、20 mg·kg-1·d-1的剂量进行灌胃，分娩后立即处死孕鼠和子鼠，并测定其体内的Ag含量，评价肝毒性、氧化应激参数，并进行组织病理学评价，结果发现与对照组相比孕鼠体重增加较低，且在子鼠体内检测到Ag的存在，孕鼠和子鼠氧化应激水平增加，脑组织病理学显示海马硬化发病率增高。虽然纳米银胎盘转移的动物实验数据不能简单地外推到人，但是胎盘是哺乳动物最具物种特异性的器官，胎盘转移研究是确定纳米银对人体是否具有发育毒性的关键[23]。

2.5　对皮肤的毒性

皮肤作为人体最大的器官，是抵御病原微生物和外来化学物质入侵机体的第一道防线，具有重要的保护和屏障作用。经皮接触是纳米银的主要暴露途径之一，因此研究纳米银对皮肤的损伤作用尤为重要。Kim等[24]等用纳米银在0～2 000 mg·kg-1的剂量范围内分别对大鼠、家兔和豚鼠进行染毒来研究纳米银的皮肤毒性、对眼、皮肤刺激腐蚀性和皮肤致敏性，结果发现在皮肤毒性试验中，0～2 000 mg·kg-1的剂量范围内，大鼠没有出任何异常症状和体征；同样，在家兔的急性眼、皮肤刺激腐蚀实验中，试验对象未出现明显的临床症状；但在皮肤致敏试验中，豚鼠皮肤上表现出离散片状红斑，表明纳米银有轻微的皮肤致敏性。Samberg等[25]在用0.544 pg·mL-1～34.0 μg·mL-1的纳米银对人的表层角质形成细胞(HEKs)进行染毒的细胞毒性试验中发现，未清洗的银纳米颗粒使HEKs的生存能力呈剂量依赖性降低，IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量增加，显微镜和超微结构观察显示高剂量组发生局部炎症及皮肤角质层上层的纳米银聚集。目前关于纳米银对皮肤的毒性研究尚不充分，现有的科学研究证明纳米银会造成皮肤发生炎症反应、过敏反应；虽然鲜有关于纳米银对皮肤产生较为严重的毒性作用的报道，但由于纳米银在各种医用辅料及外用药中应用广泛，与人体皮肤接触的机会不亚于任何一种暴露途径，因此关于纳米银对皮肤的毒性试验研究还有待加强。

3　纳米银毒作用的影响因素(Influencing factors of toxic effects of silver nanoparticles)

纳米银对机体的毒性作用受到多种因素的影响，如粒径、表面修饰及表面电荷等。Recordati等[26]对雄性CD-1小鼠静脉注射不同粒径(10、40、100 nm)的纳米银后，发现纳米银主要集中分布于脾脏和肝脏，其次是肺、肾和脑，且与40、100 nm的纳米银相比10 nm的银纳米颗粒在各器官中的浓度最高，对器官的损伤程度最大，该研究证明纳米银对器官发挥毒作用呈尺寸依赖性，颗粒越小越容易分布到靶器官，对器官的损伤越严重。有学者用不同包被(柠檬酸盐、聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸-谷胱甘肽、阿拉伯树胶等)的纳米银对青鳉进行试验，发现纳米银的表面涂层材料影响Ag+释放，导致机体对钠含量的调节受到影响[27]。Long等[28]在研究中发现表面为负电荷的纳米银可导致小鼠血浆中的血浆激肽释放酶原裂解，使纳米银的分布受到影响，而表面为正电荷或者中性的纳米银则没有这种效应。影响纳米银生物效应的因素还有很多，如形状、摄入剂量、试验对象等等，因此进行纳米银生物效应研究时要充分考虑各方面的因素，以确保试验的有效性和可行性。

4　纳米银的毒作用机制(The toxic mechanism of silver nanoparticles)

有关纳米银毒性的动物试验大多数都是通过病理、生化检查来观察毒性终点，而对毒作用机制并没有进行过多深入的探讨。目前关于纳米银的毒作用机制还不是很清楚，现有的资料普遍认为纳米银的毒作用由银离子(Ag+)释放、活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的产生、氧化应激、炎症反应介导。最新的研究发现纳米银的毒性还可能与内质网应激和自噬有关。

4.1　Ag+释放

大量证据表明，纳米银的毒性作用可由粒子表面释放的银离子引起[29]。为了研究纳米银的毒作用机制，Matteis等[30]用完全表征的纳米银对HeLa细胞(人宫颈癌细胞)和A549细胞(人肺癌细胞)进行染毒，经荧光探针检测发现在活细胞内有Ag+存在，Ag+促使金属硫蛋白激活，进而导致细胞死亡。该试验表明纳米银释放的Ag+可产生细胞毒性。Xu等[31]用纳米银对斑马鱼胚胎进行染毒，研究发现纳米银通过释放Ag+促使斑马鱼载黑素细胞基因mitfa和dct、神经嵴细胞基因Pax7表达下调，从而导致斑马鱼的黑色素生成受到抑制。该研究证明纳米银在发挥生物效应往往是通过释放Ag+实现的。此外，还有学者证实纳米银释放Ag+的速度越快，抗菌活性越显著[32]。

4.2　ROS产生与氧化应激

几乎所有研究都表明，纳米银可使体内ROS浓度增加，所产生的ROS与细胞膜表面蛋白结合，破坏细胞膜的完整性从而改变细胞膜的渗透性，最终导致细胞死亡。McShan等[33]指出纳米银可穿透细胞膜，通过产生ROS造成氧化应激并破坏细胞成分，包括：DNA损伤、抗氧化酶的激活、抗氧化分子的消耗(例如，谷胱甘肽)、蛋白质加合物生成以及对细胞膜的损伤。细胞成分的破坏造成细胞功能受损，如蛋白质氧化修饰产生蛋白质自由基、脂质过氧化启动、DNA链断裂、核酸修饰，此外，ROS通过激活氧化还原敏感转录因子调节基因的表达，并通过调节信号转导引发炎症反应[34]。纳米银产生ROS作用于细胞，细胞的各种抗氧化物质SOD、氢酶、谷胱甘肽等含量和活性升高以对抗活性氧ROS的损伤作用，当抗氧化作用不足以抵抗活性氧的巨大的作用时，抗氧化物质含量下降，细胞死亡。此外，研究还发现纳米银不仅可使正常人肺成纤维细胞以及人神经胶质瘤细胞中ROS含量增加，还能够引起线粒体内ATP减少，并造成DNA损伤，细胞停留在G2期和M期[35]。

4.3　炎症反应

纳米银进入机体后往往通过细胞内信号通路增加ROS的产生进而引起氧化应激并促进炎症反应的发生[36]。在用人肝癌细胞株C3A进行纳米银的毒性研究中发现，纳米银能减少白蛋白的释放，并且使多种炎症介质IL-8/MIP-2、I1-1R1、TNF-α表达增加。Braakhuis等[37]在给大鼠吸入暴露不同粒径的纳米银7 d后，发现支气管肺泡灌洗液中的细胞计数、促炎细胞因子等肺毒性参数呈剂量依赖性增加，肺泡壁增厚，多病灶整合，局部炎细胞浸润，细胞质水肿，表明纳米银可诱导炎症发生。Bermejo-Nogales等[38]用0.003～93.5 μg Ag·mL-1的AgNPs溶液(<20 nm)给鱼类细胞株(PLHC-1细胞)染毒，结果发现在高剂量暴露组细胞内ROS水平达到基础水平的3倍，同时细胞中出现许多脂滴和空泡、线粒体和高尔基体肿胀，表明AgNPs可以破坏细胞器并使细胞发生炎症。需要特别指出的是，氧化应激和炎症反应之间存在“扩大循环”：促炎症细胞因子能够增加氮氧化物/NADPH氧化酶家族的表达和激活，导致大量自由基的产生；除了氧自由基的炎性作用，氧化剂可通过激活转录因子、低氧诱导因子等调节炎症介质的释放，从而导致氧化应激和炎症反应之间相互引发、相互促进。也就是说氧化应激可能具有双重作用，既作为效应器也作为调节器，氧自由基、氧化剂增加炎症介质释放，促炎细胞因子促进大量自由基的产生。因此，炎症反应也是纳米银产生毒作用不可缺少的原因之一。

4.4　内质网应激

内质网是细胞内一种重要的细胞器，其主要功能是折叠胞内蛋白质，补充脂质和固醇，细胞的氧化性损伤将导致这些重要功能的中断，从而引起内质网应激[39]。内质网应激是体内保守细胞对抗损伤的一种自我保护机制[40]。在纳米银对人类细胞系和斑马鱼的毒性研究中，已经发现内质网应激可作为细胞毒性的标志[41]。Chen等[42]在用纳米银给小鼠进行尾静脉染毒的研究中发现，在暴露纳米银8 h后，纳米银迅速分布到各个器官组织中，其中肝和脾中纳米银的含量最丰富，在对这2个器官进行内质网应激水平的检测中发现，HSP70、BIP、p-IRE1、p-PERK等内质网应激相关蛋白含量显著增加，且存在剂量反应关系；xbp-1s和chop等内质网相关基因在肝的高剂量组中高表达，而在脾中未发现异常的变化。该研究证实纳米银发挥毒性作用可由内质网应激介导。

4.5　自噬

作为一种以溶酶体为基础的胞内降解过程，自噬对于维持细胞内稳态非常重要，基础水平的自噬与胚胎发育、病原体防御、细胞的自我调节等过程密切相关，纳米颗粒对自噬的诱导在过去的10年中一直被深入研讨[43]。越来越多的研究表明，自噬作为细胞的一种防御机制可被纳米颗粒刺激以对抗纳米物质的毒性作用[44]。自噬的发生是一个十分复杂的过程：自噬前体形成，自噬前体延长包裹自噬的底物，自噬泡形成，自噬泡与溶酶体融合完成底物降解。这个过程需要多种蛋白的参与，根据自噬发生的不同阶段,可把这些核心自噬蛋白分为5类：Atg1/ULK1蛋白激酶复合体、Vps34-Atg6/Beclin1和III型PI3K复合体、Atg9/mAtg9、Atg5-Atg12-Atg16连接系统和Atg8/LC3连接系统[45]。

因为自噬能够选择性去除压力介导的蛋白质聚集及受损细胞器，因此纳米银诱导的自噬通量缺陷可导致严重的毒性反应，另外，纳米银能够干扰泛素修饰，而泛素不仅能够调节自噬的激活、稳定和选择性还能够影响自噬清除途径相关蛋白的转运，所以自噬清除途径的受损与纳米银的细胞毒性有着不可忽视的相关性[46]。在一项体内试验研究中，Lee等[47]以500 mg·kg-1的剂量对SD大鼠腹腔注射AgNPs(10～30 nm)，在暴露后1、4、7、10、30 d后处死，结果发现第1天开始细胞ATP减少，LC3-II蛋白高表达，自噬水平在第1天达到峰值，细胞凋亡在第4天开始逐渐增加，第10天开始出现炎症反应。Mishra等[48]研究发现纳米银可导致HepG-2细胞自噬相关蛋白LC3B和前自噬蛋白高表达，激活NLRP3-炎性小体(Caspase-1、IL-1β)，损伤自噬溶酶体途径，加速乳酸脱氢酶的释放；Miyayama等[49]发现纳米银可导致人肺上皮细胞A549溶酶体功能障碍、细胞损伤；Lee等[50]的研究同样表明NIH 3T3细胞暴露于纳米银后可导致氧化应激、自噬和细胞凋亡，这些研究均证明纳米银毒作用机制可能与自噬-溶酶体系统受损有关。

5　结语(Summary)

纳米技术的飞速发展使越来越多的纳米产品走进人们的生活，人们在享受纳米产品给生活带来极大便利的同时也受到其对健康所带来的威胁。综上所述，纳米银会对机体的各个系统造成损害，包括消化系统、呼吸系统、生殖系统，神经系统等，但大多数关于纳米银的毒性研究都是利用动物试验及离体培养细胞试验得出的结论，而不同的试验模型会影响纳米银的毒作用，纳米银特殊的理化性质也会对实验结果产生影响，因此在由试验结果外推到人时仅仅靠毒理学研究得出的结论是远远不够的，还需要更多流行病学调查的证据。此外，目前关于纳米银的毒作用研究还主要停留在分析其生物分布、细胞损伤、器官系统损伤等病理研究层面，而对机制研究开展得较少，到目前为止关于纳米银的毒作用机制仍然是一知半解。这提示我们在将来的纳米毒理学研究中，关于纳米银的毒性机制的研究任重而道远，要尽快探索出纳米银发挥毒作用的机制，这样将有利于促进纳米银材料的进一步应用及发展并为纳米银产品的危险度评价的建立奠定基础。

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