麦麸酯酶对有机磷及氨基甲酸酯类农药的动力学特性

侯晓艳 ，姜 露 ，叶 麟，2，申光辉，黎杉珊，罗擎英，吴贺君，张志清*

(1.四川农业大学 食品学院，四川 雅安 625014；2.泸州市产品质量监督检验所，四川 泸州 646000)

我国农药残留超标的问题十分普遍，部分农药残存量远超国家标准，统计数据表明蔬菜和水果中农药残留以有机磷和氨基甲酸酯类农药为主[1]。但由于农药在化学防治中不可替代的地位和作用[2]，其使用不能够完全被禁止，当前最为关键的是加强对果蔬等农副产品中农药残留的检测，同时采取有效措施禁止检测不合格的产品上市[3]。

酶抑制法是一种快速检测农药残留的方法，虽不能定量地检测农残，但方便省时，能够满足市场需求，我国已将该方法列入国家标准[4]。其检测所用酶源主要来自动物及昆虫体内提取的胆碱酯酶和从植物中提取的植物酯酶[5-10]。胆碱酯酶来源有限、价格偏高，且保存期短，严重制约了其在快速检测中的应用[11]。相关研究发现,植物酯酶应用于有机磷和氨基甲酸酯类农药检测的效果较好[12]，且来源广泛、成本低、提取方便，其对农药的敏感性不逊于胆碱酯酶[13]。目前应用较多的植物酯酶主要从小麦或小麦面粉及植物种子中提取，而以小麦加工的副产物——麦麸为酶源的研究鲜见报道。

本课题组前期从麦麸中成功分离纯化得到较高单位酶活的麦麸酯酶，并对其酶学性质等进行了系统研究[14]。本文在前期研究基础上，通过测定农药抑制酶的动力学常数(Ki、Ka、K2)及半抑制浓度(IC50)揭示麦麸酯酶的动力学特性。研究结果可为麦麸酯酶应用于农药检测提供理论基础。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

实验材料：麦麸(雅安市售)。

氨基甲酸酯类农药标准品：叶蝉散(≥99.8%)、丁硫克百威(1.00 mg/mL)、西维因(≥99.8%)，农业部环境保护科研监测所；有机磷类农药标准品：甲基对硫磷(1.00 mg/mL)、敌敌畏(1.00 mg/mL)、乐果(1.00 mg/mL)，农业部环境保护科研监测所；α-乙酸萘酯：上海纪宁实业有限公司；固兰B盐：西化仪(北京)科技有限公司。

农药标准液：6种农药全部配制成10 mg/L的储备液(丙酮)，将敌敌畏、西维因、叶蝉散用0.20 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2)稀释成0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 mg/L标准溶液；乐果、甲基对硫磷用0.20 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2)稀释成0.50、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00 mg/L标准溶液；丁硫克百威用0.20 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2)稀释成0.10、0.16、0.25、0.50、0.72、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00 mg/L标准溶液。

1.2 仪器设备

FW-100高速万能粉碎机(杭州汇尔仪器设备有限公司)；759s紫外可见分光光度仪(上海棱光技术有限公司)；LGJ-10冷冻干燥机(北京松源华兴生物技术有限公司)；ST16R冷冻离心机(美国赛默飞世尔科技有限公司)；GC-2010 气相色谱仪(日本岛津公司)。

1.3 实验方法

1.3.1麦麸酯酶的提取及相关指标的测定麦麸酯酶的提取参照文献[15]的方法。

麦麸酯酶单位酶活的测定参照文献[14]方法进行，并按公式(1)计算：

(1)

式中:EAs为麦麸酯酶的单位酶活(U/mL，将每分钟催化得到1 nmolα-萘酚所需的酶量定义为1U)；k为α-萘酚溶液(pH 7.2)标准曲线斜率；b为标准曲线截距；OD540 nm为540 nm处样品的吸光度；V0为反应液总体积(mL)；V为加入的酶液体积(mL)；V1为原酶液总体积(mL)。

麦麸酯酶抑制率的测定参考文献[15]方法，并稍作修改。实验组反应体系为：将0.25 mL麦麸酯酶加入4.25 mL农药中并混合均匀，于35 ℃恒温水浴反应30 min后，加入0.25 mLα-乙酸萘酯溶液，置于40 ℃恒温水浴5 min，加入0.25 mL固兰B盐和0.25 mL表面活性剂并摇匀，最后加入0.25 mL盐酸溶液，摇匀，测定吸光度。对照组中，以磷酸盐缓冲液(pH 7.2)代替农药，空白对照为未加α-乙酸萘酯溶液的反应体系，酶活抑制率公式：

(2)

式中，OD0为对照组吸光度；OD1为实验组吸光度。

1.3.2动力学常数(Ki、Ka、K2)的测定参考文献[16]方法并修改如下：将实验分为对照组和测试组，分别取0.25 mL麦麸酯酶溶液加入两支15 mL试管中，在测试组试管中加入4.25 mL抑制剂(不同浓度的农药溶液)。对照组以磷酸盐缓冲液代替农药溶液，35 ℃水浴平衡，根据抑制剂浓度定时取样，测定麦麸酯酶抑制率。通过改变抑制剂浓度、取样间隔时间，以酶活和时间作图确定各农药与酶作用的双分子反应速率常数(Ki)、解离常数(Ka)和磷酰化(氨基甲酰化)常数(K2)。

由于目前对有机磷及氨基甲酸酯类农药抑制植物酯酶的动力学机制尚未有研究报道，故本文以乙酰胆碱酯酶的抑制动力学理论为假设进行研究，主要反应过程如式(3)所示：

(3)

式中，E为自由酶，AX是带有基团X的有机磷酯或氨基甲酸盐，EAX为可逆复合物，EA是共价的磷酸化(氨基甲酰化)酶，X为解离基团，Ka为反应物和复合体间的解离常数，用来衡量酶和反应物结合能力强弱，其大小由分子结构特征决定，K2是磷酰化或氨基甲酰化的速率常数，Ki为双分子反应速率常数，其值为K2/Ka。

(4)

(5)

Ka=K2/Ki

(6)

式中，[I]为农药浓度，(e)为经抑制后酶的活性，E为对照组酶活。当农药固定为某一浓度时，求出农药与酶作用不同时间的ln[(e)/E]，以ln[(e)/E]对时间t作图，线性拟合即得某一浓度下农药的Kapp。以不同浓度下1/Kapp与农药浓度的倒数1/[I]作图，线性拟合，截距的倒数即为K2,斜率的倒数即为Ki，根据式(6)计算Ka。

1.3.3IC50值的测定分别取0.25 mL麦麸酯酶溶液加入两支15 mL试管中，按浓度从高到低依次取4.25 mL不同浓度的抑制剂(以pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液配制的农药)加入测试组试管中。同时，在对照组试管中加入4.25 mL pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液，35 ℃水浴平衡30 min后测定麦麸酯酶抑制率。

E为对照组酶活的吸光度；e为农药抑制麦麸酯酶后剩余酶活的吸光度；H为酶活的百分抑制率，i为农药浓度，则：

H=[1-(e/E)]×100%

(7)

(8)

将lgi对lg(it)作图，当lg(it)=0时，对应的i即为IC50。

1.3.4麦麸酯酶抑制法在果蔬农药残留检测中的应用利用制备的麦麸酯酶抽样检测本地农贸市场中常见果蔬的农药残留情况，阳性样品采用气相色谱法验证。

按GB/T 5009.218-2008[17]方法进行有机磷和氨基甲酸酯类农药的提取和净化。

气相色谱检测条件[18]：色谱柱ZB-5(30 mm×0.32 mm×0.25 μm)，分流比1∶50；载气流速(N2)：10.0 mL/min；H2：30.0 mL/min；空气：100 mL/min。程序升温:150 ℃保温3 min，以8 ℃/min升温至 250 ℃，净化5 min。

1.3.5数据处理所有试验均重复3次，结果以平均值±标准差表示，利用SPSS20.0软件进行统计分析，并利用Origin 9.0作图。

2 结果与讨论

2.1 农药抑制麦麸酯酶动力学常数

表1 有机磷农药与麦麸酯酶作用的Kapp及r2值Table 1 The Kapp and r2 values of organophosphorus pesticide and wheat bran esterase

表2 各有机磷农药的动力学常数Table 2 The values of kinetic constants of organophosphorus pesticide

表3 氨基甲酸酯类农药与麦麸酯酶作用的Kapp及r2值

表4 氨基甲酸酯类农药的动力学常数Table 4 Kinetic constants of carbamate pesticides

2.1.1有机磷农药抑制麦麸酯酶的动力学常数根据“1.3.2”动力学常数的求解方法，计算3种有机磷农药与麦麸酯酶作用的双分子反应速率常数(Ki)。

以敌敌畏、乐果和甲基对硫磷在不同浓度下的ln(e/E)值与时间拟合直线，其斜率为-Kapp，敌敌畏、乐果和甲基对硫磷不同浓度所对应的Kapp及r2如表1所示。

以表1中农药的浓度与其对应的Kapp分别作图，得到3种有机磷农药的Ki、Ka、K2值，结果如表2所示。

在生态毒理学研究中，通常以双分子速率常数(Ki)来评价酯酶对农药的敏感性，Ki值越大，说明农药的抑制作用越强，或者酶的敏感性越高[19]。由表2可知，3种有机磷农药的双分子速率常数Ki的大小顺序为：敌敌畏>甲基对硫磷>乐果，且敌敌畏的Ki值分别是甲基对硫磷的34倍，乐果的68倍，这表明麦麸酯酶对敌敌畏的敏感性高于甲基对硫磷，而对乐果的敏感性最低。麦麸酯酶对不同有机磷农药的敏感性不同，主要与农药生物活性关系密切的取代基有关，取代基在其结构中的位置不同，活性也不同[20-21]。实验中有机磷农药与麦麸酯酶作用的解离常数Ka大小依次为：乐果>甲基对硫磷>敌敌畏，说明敌敌畏与麦麸酯酶的亲和力最强，其与麦麸酯酶形成复合体的能力约为甲基对硫磷的58倍，乐果的122倍。抑制剂(农药)的疏水性以及供电性对解离常数Ka值有较大影响，若农药的疏水性和供电性弱，与酯酶的结合松散，则亲和力小[22-23]。磷酰化常数K2的大小顺序依次为：乐果>甲基对硫磷>敌敌畏，说明乐果与麦麸酯酶生成的中间体最易磷酰化。

2.1.2氨基甲酸酯类农药抑制麦麸酯酶的动力学常数根据“1.3.2”方法，计算3种氨基甲酸酯类农药与麦麸酯酶作用的双分子反应速率常数。

以不同浓度的叶蝉散、西维因和丁硫克百威的ln(e/E)值随时间的变化进行拟合，其直线斜率即为-Kapp值，叶蝉散、西维因、丁硫克百威各个浓度对应的Kapp及r2见表3。

用表3中各农药的Kapp和其对应的浓度分别作图，得到3种氨基甲酸酯类农药的Ki、Ka、K2值，结果见表4。

由上述结果可知，不同种类氨基甲酸酯类农药抑制麦麸酯酶的动力学常数不同。由表4可知，3种氨基甲酸酯类农药与麦麸酯酶作用的双分子速率常数Ki大小依次为：叶蝉散>西维因>丁硫克百威，且叶蝉散的Ki值约为西维因的1.27倍，丁硫克百威的2倍，这说明麦麸酯酶对叶蝉散的敏感性高于西维因，而对丁硫克百威的敏感性最低。实验中不同氨基甲酸酯类农药与麦麸酯酶作用的Ka值大小依次为：丁硫克百威>西维因>叶蝉散，说明叶蝉散与麦麸酯酶的结合能力最强。表4数据表明，叶蝉散与麦麸酯酶形成复合体的能力约为西维因的1.5倍、丁硫克百威的2倍。实验中不同氨基甲酸酯类农药与麦麸酯酶作用的K2值大小依次为：西维因>丁硫克百威>叶蝉散，但其值均在0.05左右。从表2和表4中可以看到叶蝉散对麦麸酯酶的亲和常数Ka低于敌敌畏，说明叶蝉散对麦麸酯酶的亲和能力小于敌敌畏对麦麸酯酶的亲和力。而相同浓度下叶蝉散抑制反应所需平衡时间较长(敌敌畏需30 min，叶蝉散则需35 min)。

农药与酯酶亲和能力越高，其双分子速率常数越大，麦麸酯酶对其敏感性越高，而3种氨基甲酸酯类农药的氨基甲酰化能力相差不大，说明麦麸酯酶对农药敏感性大小与农药与麦麸酯酶的亲和力强弱关系密切，而与磷酰化和氨基甲酰化作用强弱的相关性较小，该结果与张佳佳等[24]的研究结果一致。推测其原因可能是，与酶亲和力低的化合物，扩散到酶活性中心的速率较慢，而该过程恰恰是底物与酶反应的限速步骤，从而导致酶与其反应的双分子速率常数较小。Apilux等[25]认为有机磷农药的磷酰化以及氨基甲酸酯类农药的氨基甲酰化作用与乙酰胆碱酯酶的敏感性关系不大，Storm等[26]也指出化合物与乙酰胆碱酯酶之间的亲和力是一个非常重要的因素。

2.1.3农药抑制麦麸酯酶的半数抑制浓度(IC50) 根据百分抑制率H，求得lg(it)和lgi，再以lg(it)为横坐标，lgi为纵坐标作图，线性拟合得到一条直线。令lg(it)=0，则对应的i即为IC50。

根据图1，计算各农药对麦麸酯酶的IC50值，结果分别是敌敌畏0.176 mg/L，乐果2.583 mg/L，甲基对硫磷1.754 mg/L，叶蝉散0.489 mg/L，西维因0.799 mg/L，丁硫克百威2.035 mg/L。3种有机磷农药对麦麸酯酶的IC50值大小顺序为：乐果>甲基对硫磷>敌敌畏，说明敌敌畏对麦麸酯酶的敏感性高于乐果与甲基对硫磷。3种氨基甲酸酯类农药对麦麸酯酶的IC50值大小顺序为：丁硫克百威>西维因>叶蝉散，说明叶蝉散对麦麸酯酶的敏感性高于丁硫克百威和西维因,与前述6种农药抑制麦麸酯酶的动力学常数推算的敏感性趋势完全一致。

2.2 麦麸酯酶抑制法在果蔬农药残留检测中的应用

为验证麦麸酯酶抑制法检测农药的有效性，从雅安市农贸市场购买常见的13种蔬菜和水果样品，每个样品检测2次。根据姜露等[27]的方法进行初筛，对于酶活抑制率高于10%的样品采用气相色谱法进行定量检测，结果见表5。由表5可知，莴笋叶、四季豆和葡萄的检测结果(酶活抑制率)高于10%。再用气相色谱对这3个样品进行检测，发现葡萄中含有乐果，而其他2个样品均未检出具体的农药种类。此外，由于苹果样品提取液放置时间过久会发生褐变反应而影响检测结果，故本方法不能用于对苹果的农药残留检测。可见，样品前处理方法也是农残分析检测的关键步骤。

表5 新鲜果蔬农残检出情况Table 5 Detection of pesticide residues in fresh fruits and vegetables

“+” represents positive，“-”represents negative and “——”represents undetectable

3 结 论

本研究以乙酰胆碱酯酶的抑制动力学理论为假设进行了麦麸酯酶抑制动力学特性的研究。各农药与麦麸酯酶作用的动力学常数与IC50值表明，各农药对麦麸酯酶具有选择性抑制作用。麦麸酯酶对3种有机磷农药的敏感性大小依次为：敌敌畏>甲基对硫磷>乐果，对3种氨基甲酸酯类农药的敏感性大小依次为：叶蝉散>西维因>丁硫克百威。为验证麦麸酯酶抑制法检测农药残留的可行性，从农贸市场购买果蔬进行检测，结果显示酶活抑制率高于10%的样品为莴笋叶、四季豆和葡萄，且葡萄中为乐果残留，说明本方法具有一定实用性。此外本研究仅是通过求解农药与麦麸酯酶作用的动力学常数来解释其对麦麸酯酶的抑制作用强弱，而抑制作用的类型、抑制机理有待进一步深入研究。

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