高效液相色谱法同时测定复方胆通片中5种蒽醌类成分含量

金贤武 ，付彩群 ，黄道明 ，黄 平 ，周兴卓

（1.江西省上饶市食品药品检验所，江西 上饶 334000； 2.江西医学高等专科学校，江西 上饶 334000；3.青岛大学附属医院，山东 青岛 266000）

复方胆通片是由茵陈、胆通、穿心莲、溪黄草和大黄5味中药加工制成，具有清热利胆、解痉止痛的功效，临床主要用于治疗胆囊炎、胆管炎、急慢性胆囊炎、肝硬化等[1]。现行质量标准含量测定项下以胆通为指标成分进行含量测定[2]。目前，有研究在原标准基础上增加了溪黄草、胆通、大黄的薄层色谱鉴别，建立了测定羟甲基香豆素和齐墩果酸的高效液相色谱（HPLC）法[3]。也有研究以绿原酸、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯、羟甲基香豆素等成分为指标性成分[4－6]建立测定方法。鉴于处方中大黄的主要有效成分为蒽醌类化合物[7]，其具有较强的泻下、抗炎、镇痛、抗病毒等生物活性[8－11]，常作为药材或制剂质量控制及评价的指标性成分，故本研究中以大黄的5种主要成分——蒽醌类成分为目标成分，建立同时测定复方胆通片中该5种成分含量的高效液相色谱法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司)，包括 Waters e2489检测器，Empower工作站；CPA225D型十万分之一电子天平（德国赛多利斯公司）；KQ－500DE型超声机（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

芦荟大黄素对照品（批号为110796－201409，纯度98.4% ），大黄酸对照品（批号为 110757 －201302，纯度98.1% ），大黄素对照品（批号为 110756 －201211，纯度99.2% ），大黄酚对照品（批号为 110796 －201410，纯度98.7%），大黄素甲醚对照品（批号为 110766－201205，纯度98.9%），均购自中国食品药品检定研究院；复方胆通片购自利群大药房；色谱甲醇（德国Merck公司）；磷酸、分析甲醇（北京化工产品有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomonex® －C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 －0.1% 磷酸水溶液（75 ∶25，V/V）；流速：1.0 mL /min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

对照品溶液：称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为 57.6，27.2，64.3，320.6，61.8 μg /mL的混合对照品溶液，摇匀，即得。

供试品溶液：取复方胆通片10片，去包衣，磨细，取约1.0 g，精密称定，置 100 mL锥形瓶中，加入25 mL甲醇，回流提取30 min，放冷，过滤，用甲醇洗涤滤纸和药渣，至无色，合并滤液，蒸干，残渣加2.5 mol/L硫酸溶液 10 mL，超声 5 min后加三氯甲烷 10 mL，回流提取1.0 h，冷却，转移至分液漏斗中，用CHCl3洗涤容器数次，合并洗液，取 CHCl3，酸液再用 10 mL CHCl3萃取3次，合并CHCl3液，挥去，残渣加甲醇使其溶解，定容至10 mL，摇匀，即得。

阴性对照品溶液：参照处方，取茵陈、胆通、穿心莲、溪黄草4味中药，按配方比例及供试品溶液制备方法制成缺大黄的阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别精密吸取2.2项下3种溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按2.1项下色谱条件进样分析。结果见图1。可见，5种被测成分能达到完全分离，阴性对照无干扰。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：分别精密吸取对照品溶液0.5，1.0，2.0，2.5，5.0，10.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度。分别精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪分析，以峰面积(Y)对进样质量浓度(X)进行线性回归，结果见表1。

精密度试验：精密吸取混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的 RSD分别为 1.62% ，2.01% ，1.31% ，0.75% ，1.59%(n ＝ 6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液（批号为140902），按 2.1 项下色谱条件分别于 0，2，4，6，8，12，24 h 时进样分析，记录峰面积。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的 RSD分别为2.41%，1.17%，2.47% ，0.85% ，1.72%(n＝ 7)，表明 5 种成分在甲醇溶液中24 h内稳定。

表1 5种成分线性回归方程和线性范围(n＝6)

表2 加样回收试验（n＝6）

表3 样品含量测定结果（mg/g，n＝3）

重复性试验：取同一批（批号为140902）样品，依法平行制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，记录峰面积，并计算 RSD。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的 RSD分别为0.97% ，1.49% ，2.35% ，1.56% ，1.04%(n ＝ 6)，表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量（批号为140902）的样品6份，每份约0.5 g，按1∶1的比例加入对照品，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，计算回收率。结果见表2。

2.4 样品含量测定

取不同批次样品约1.0 g，每个批次平行取3份，制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，以外标法计算含量。结果见表3。

3 讨论

3.1 提取方法选择

参照单因素考察法，试验中比较了2种提取方法（超声、回流），提取时间（30，45，60 min），提取溶剂（甲醇、乙醇），料液比（1 ∶10，1 ∶25，1 ∶50），结果显示，以 25倍量的甲醇回流提取30 min后再水解提取5种蒽醌类成分所得含量最高。

3.2 水解条件选择

蒽醌类成分易与糖结合，大部分以苷的形式存在。在测定时需先水解成苷元，结果显示，采用2.5 mol/L硫酸的水解效果优于8%的盐酸[12]，故选用2.5 mol/L的硫酸水解后氯仿萃取的提取方法。

3.3 流动相选择

试验中比较了甲醇－水[13]，甲醇－0.1%磷酸水[14]和乙腈－0.1%磷酸水溶液[15]3种流动相。结果显示，当以甲醇 －0.1% 磷酸水溶液（75∶25，V/V）为流动相及洗脱程序时，5种蒽醌类成分均能与相邻色谱峰完全分离，且峰形较好，可能是蒽醌类化合物大都具有酚羟基，显弱酸性，在流动相中加入一定的酸可抑制其电离，从而改善峰形。

3.4 研究价值

复方胆通片现行标准中含量测定项以羟甲基香豆素为指标成分，并未收入蒽醌类成分含量测定。有文献以大黄素为指标成分，建立了复方胆通片中大黄素的含量测定方法，但单一成分并不能完整地反映和保证药物的疗效和质量，故本试验中建立了复方中成药大黄的5种蒽醌类成分含量测定方法，为以5种蒽醌类成分的总含量为含量测定要求的研究奠定了基础。

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