高效液相色谱法测定单叶化香树果序中没食子酸含量*

刘金坤 ，应 敏 ，王 琴 ，敖 利 ，吴 斌 △

（1.重庆市中医院中医药基础研究室，重庆 400021； 2.重庆大学附属肿瘤医院，重庆 400030；3.重庆市中医院药剂科，重庆 400021）

化香树 Platycarya strobilacea Sieb.et Zucc.又名必栗香、烧为香、杀虫鱼（《本草纲目》）[1]，在我国分布广泛，主要产于黄河流域及其以南地区，前期调查发现，陕西汉中地区秦岭山地、四川广元地区具有大量可利用资源。《中华本草》[2]《中药大辞典》[3]记载，化香树果序性温、味辛，有清热解毒、活血化瘀、清肿排脓、通窍止痛的功效。化香树果序中含有糖及其苷类、酚类和鞣质、有机酸、黄酮类、生物碱、甾醇及三萜、蒽醌等化学成分[4－5]。挥发油成分中倍半萜化合物含量最多，具有杀菌、抗肿瘤、抗炎、止痛、消肿、清热解毒等功效[6－7]，这与化香树果序药效基本一致。近年来，关于化香树中没食子酸的含量测定研究较少，而单叶化香树果序的高效液相色谱（HPLC）分析方法尚无系统研究。为此，本研究中建立了HPLC法，以测定陕西汉中产单叶化香树中没食子酸含量，并对不同提取溶剂、不同波长条件下没食子酸含量进行系统分析，为其资源开发提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（Agilent公司）；BT25S型电子天平（德国赛多利斯集团公司）；Thermo Pico17型离心机，Thermo Genepuer超纯水仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Q－250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH－S11－2型电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械厂）；TGL－16G型台式高速离心机（上海医用分析仪器厂）。

1.2 试药

没食子酸对照品（批号为 110831－201605），鞣花酸对照品（批号为111959－201602），槲皮素对照品（批号为100081－201509)，均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，磷酸为优级纯（购自Sigma公司）；试验用水为纯水仪制超纯水，其他试剂均为分析纯。化香树样品，2016年8月至12月采于陕西省汉中市略阳县硖口驿镇大院子村，经重庆市中医院药剂科敖利主任中药师鉴定为胡桃科化香树属单叶化香树果序，将采来的单叶化香树果序样品除去种子后粉碎，过80目筛，备用。

2 方法与结果

2.1 提取工艺考察

目前，化香树果序的提取主要是针对其中所含多糖、黄酮类、多酚类等的有效部位和鞣花酸、没食子酸等有效成分进行提取，主要选择水、甲醇、55% ～70%乙醇为溶剂进行提取[8－10]，采用响应面法优化提取工艺。

本试验中采用HPLC法测定单叶化香树中没食子酸含量，分别通过水、60%乙醇、95%乙醇提取，结果水提取物中没食子酸含量最高，同时发现水提取、醇提取的图谱峰有显著性差异（见图1）。说明提取溶剂不同，所得单叶化香树果序提取物化学物质有很大差异，确定了单叶化香树果序以水作为提取溶剂，与圆果化香树果序的提取方法一致[11]。

图1 未知成分不同溶剂、不同波长检测的高效液相色谱图

此外，取化香树果序1.0 g，3份，各加入 50 mL纯水、60%乙醇、95%乙醇提取，以甲醇－0.2%磷酸水溶液（55∶45）为流动相，发现在6.2 min时有一含量较高的峰，且以60%乙醇提取含量较高，254 nm波长处吸收较强，分别用没食子酸、鞣花酸、槲皮素标定，结果均不符（见图1），因此有待进一步深入研究。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的Diamonsil®C18（2）柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：甲醇 －0.2% 磷酸水溶液（3 ∶97，18 ∶85，55 ∶45)；检测波长：254，255，270，274 nm；进样量：10 μL；流速：1.0 mL /min。在此色谱条件下，没食子酸[C6H2（OH）3COOH]的保留时间约为 11.1 min，详见图 2。

图2 高效液相色谱检测没食子酸不同波长紫外吸收图

2.2.2 溶液制备

对照品贮备液：称取经干燥的没食子酸对照品11.0 mg，精密称定，用50%甲醇溶解并定容至 50 mL容量瓶中，得质量浓度为220 mg/L的对照品贮备液。

供试品溶液：称取药材粉末 3份，每份 1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入蒸馏水、60%乙醇、95%乙醇各50 mL，密塞，称定质量，40℃ 超声处理（300 W，40 kHz） 60 min，放冷，密塞，再称定质量，用提取溶剂补足减失的质量，摇匀，滤过，在离心机上以3000 r/min的速率离心5 min，精密量取续滤液5 mL置棕色容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取滤液，即得。

2.2.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密吸取对照品贮备液5.000， 2.000， 1.000， 0.500， 0.250， 0.125 mL， 并 用50%甲醇稀释定容至5 mL容量瓶中，摇匀，得质量浓度为 220.00，44.00，22.00，11.00，5.50，2.75 mg /L 的系列标准溶液，按 2.1项下色谱条件依次进样 10 μL，测定。以峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程 Y＝2 559.7X＋40.057，r＝0.999 8（n＝6）。结果表明，没食子酸进样量在 0.137 5～11.000 0 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取供试品溶液 10 μL，按2.1项下色谱条件重复进样5次，测定没食子酸峰面积。结果的 RSD为0.25%（n＝5），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取单叶化香树样品，平行制备5份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样，测定峰面积，计算没食子酸含量。结果的 RSD为0.18%（n＝5），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于 1，2，4，8，12，24 h时按2.1项下色谱条件进样，测定峰面积。结果的RSD为0.74%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验：称取已知含量的单叶化香树样品5份，精密称定，分别精密加入一定量的没食子酸对照品溶液，按供试品溶液制备方法制备待测溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表1。

表1 水提单叶化香树果序中没食子酸加样回收试验结果(n＝5)

2.2.4 样品含量测定

按供试品溶液制备方法制备待测溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，按外标法计算，对陕西汉中产单叶化香树的果序中没食子酸的含量进行分析。结果水、60%乙醇、95%乙醇提取的单叶化香树果序中没食子酸平均含量分别为 2.69，0.08，0.04 mg/g（n ＝5），色谱图见图 3。

3 讨论

化香树属有单叶化香树和圆果化香树2种。单叶化香树种分布于朝鲜、日本、我国各省区，常生长在海拔600～1 300 m，有时达2 200 m的向阳山坡及杂木林中，果序卵状椭圆形至长椭圆状圆柱形，长2.5～5.0 cm，直径2～3 cm；叶总柄明显较叶轴短；小叶7～23枚。圆果化香树种为我国特有，主要分布于广东、广西、贵州，常生长于海拔450～800 m的山顶或林中；化香树果序球状，直径 1.2～2.0 cm；叶总柄与叶轴近等长或较长；小叶 3～7枚[12]。

现代药理学研究显示，化香树果序总酚和总黄酮类化合物对感染鼻炎、鼻窦炎的细菌有较强的抑制作用[13－15]。其中黄酮类化合物具有明显清除人体内自由基、抗老化、抗突变等功能，且无毒；所含没食子酸、鞣花酸和熊果酸具有抗氧化、抗癌和抗诱变活性的作用[16－18]。

流动相：前期研究中还考察了3种比例的流动相（甲醇 －0.2% 磷酸水溶液分别为 15 ∶85，5 ∶95，3 ∶97）对分离效果的影响，发现当甲醇－0.2%磷酸水溶液为3∶97时，没食子酸与其他干扰峰完全分离，峰形对称且尖锐，分离效果最好，故色谱条件中选用甲醇－0.2%磷酸水溶液（3∶97）为流动相。

图3 单叶化香树果序中没食子酸含量测定高效液相色谱图

检测波长：选择 254，270，273，274 nm 波长，发现没食子酸在270 nm波长处有最大吸收，因此选择270 nm作为检测波长。

稀释溶液：标准品和样品的稀释溶液曾选择水、60%乙醇、95%乙醇、50%甲醇和甲醇分别溶解检测，发现50%甲醇样品杂峰干扰较少，且没食子酸出峰时间约为 11.1 min，较为合适。

对比文献[19]研究发现，不同地区化香树果序中的没食子酸含量具有明显差异。化香树树皮、树干、树叶没食子酸含量也不一致[11]。而本次采摘自秦巴山地区的单叶化香树没食子酸含量较高，具有重要的潜在药用价值。

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