Ⅱ型谷氨酰胺转氨酶对缺氧骨肉瘤MG－63细胞凋亡的影响*

马 薇，张书勤，魏 柏，丰小敏

（华中科技大学同济医学院附属梨园医院肿瘤科，湖北 武汉 430077）

细胞Ⅱ型谷氨酰胺转氨酶（transgiutaminase2，TG2）在缺氧刺激下可异常表达升高，并在肿瘤细胞的增殖、分化、转移和凋亡过程中发挥重要作用[1]，有促凋亡和抗凋亡的双重作用。王建新[2]采用HEK293细胞体外实验发现，TG2抗凋亡机制可能与减少Bax产生，抑制Caspase－3和Caspase－9表达，降低细胞核内细胞色素C转导入胞浆水平，以及钙超载诱导线粒体膜的去极化过程等密切相关[2]。但其在骨肉瘤细胞中能否同样发挥抗凋亡作用，以及具体的作用机制研究还较少。本研究中通过构建骨肉瘤细胞体外缺氧培养模型，探讨缺氧条件下骨肉瘤MG－63细胞凋亡与TG2表达的关系，以及TG2抗凋亡机制与细胞色素C和Caspase－3表达的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞株、试剂和主要仪器

骨肉瘤细胞株MG－63（中国科学研究院）；鼠抗人TG2，细胞色素 C，Caspase－3单克隆抗体（美国 San Cruze公司），AP碱磷酶标记抗小鼠IgG和过氧化物酶标记羊抗鼠IgG的二抗（北京中杉生物技术公司）；FAC Sort流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

细胞置含10%小牛血清的RPMI－1640培养液（美国Sigma公司）培养，在5%CO2、37℃及饱和湿度的培养箱中培养24 h，然后用0.25%胰酶消化、传代。取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 缺氧模型构建

细胞置 CO2缺氧培养箱（5%CO2、95%N2）中、37 ℃下培养24 h。

1.2.3 分组与细胞转染

取对数生长期细胞，重悬细胞浓度为5×105/孔接种至2 mL接孔板（美国Bio－Rad公司）中，待细胞长至90%以上时分为单纯缺氧组和TG2 siRNA缺氧组，共培养 12 h。siRNA转染：纯化 siRNA分子由江苏碧云天科技有限公司完成。TG2转染组的siRNA序列为（F）5′－ GCGGGATCCGCCAGATCATTA － 3′，（R）5′－ TA CGCCCTUGGTGGCCUTGTU－3′。对照组 siRNA序列为（F）5′－ UATCGAGUACACTCAUGATCU － 3′，（R）5′－ UT GATGUCUUTAGTCCCTATU－3′。按照 Dharmafect 3试剂盒步骤进行转染，进行下一步实验。

1.2.4 观察指标和检测方法

微量滴定板法测定TG活性[1]：缺氧条件细胞培养12 h后，采用5－生物素酰氨基戊胺（BP，美国R＆D公司）标记。4℃、20 000 g超速离心10 min，使用细胞提取物包被96孔的微量滴定板（美国Bio－Rad公司）于4℃，含5%牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液（PBS）中封闭1 h。然后采用辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（北京中杉生物技术公司）于37℃孵育45 min，PBS洗涤5 min×3次。微量滴定板中加入邻苯二胺盐酸盐于室温下显色10 min，1 mol/L硫酸终止反应。显色后采用微孔板分光光度计（美国GE公司）于490 nm波长处测量吸光度（A）值。实验进行3次，取平均值。

RT－PCR法测定TG mRNA相对表达水平[2]：常规Tizol法（美国Santa Cruz公司）提取总RNA，紫外分光光度法测定其浓度和纯度，逆转录试剂盒（北京中杉生物技术公司）合成 cDNA，PCR扩增 TG2序列为（F）5′－GGGGTGAGAGAGGAAAGACC － 3′，（R）5′－ TGCAGTCTAGGGAGCTGGAT －3′，167 bp；内参 β －actin序列为（F）5′－TGACGTGGACATCCGCAAAG －3′，R：5′－CTGGA AGGTGGACAGCGAGG －3′，245 bp。反应参数为 94℃2 min，94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35 个循环，72℃ 10 min终止反应。取扩增产物 10 μL用 1.2%琼脂糖电泳鉴定产物，分析条带灰度值，结果以2－△△Ct法表示。

Western Blot法[3]测定三酰甘油（TG）、细胞色素 C和Caspase－3蛋白水平：常规方法抽提细胞核和细胞浆总蛋白，考马斯亮兰蛋白定量测定浓度和纯度。取适量样本蛋白置十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后电转移至硝酸纤维素膜上封闭，漂洗。分别加入鼠抗人TG2、Bax及cytC单克隆抗体一抗（北京中杉金桥生物有限公司，1∶1 000稀释），4℃孵育过夜，再加入兔抗鼠多克隆抗体二抗（北京中杉金桥生物有限公司，1∶500），37℃避光孵育 1 h，丽春红显色，显微镜下观察、拍照。

Sub－G1法检测凋亡细胞[4]：胰酶消化，取 2×105个细胞，70%乙醇固定，4℃孵育过夜。PBS漂洗，溴化丙啶染色，1 h内于FAC Sort流式细胞仪上检测。

1.3 统计学处理

2 结果

结果见表1和表2。单纯缺氧组细胞凋亡率显著低于 TG2 siRNA 缺氧组[（21.3 ±4.4）%vs（42.6 ±8.7）%，t＝ 5.758，P ＝ 0.031 ＜ 0.05]。

表1 两组TG2活性、蛋白及mRNA水平比较()

表1 两组TG2活性、蛋白及mRNA水平比较()

组别 胞核胞浆单纯缺氧组TG2 siRNA缺氧组t值P值TG2活性26.4 ± 2.3 12.5 ± 2.2 4.518 0.036蛋白水平31.5 ± 3.4 13.6 ± 2.9 4.627 0.034 mRNA水平26.9 ± 2.1 10.3 ± 2.3 5.103 0.026 TG2活性11.6 ± 1.8 12.4 ± 1.7 0.529 0.127蛋白水平12.9 ± 2.7 12.6 ± 2.2 0.267 0.535 mRNA水平14.7 ± 1.9 14.5 ± 1.6 0.362 0.415

表2 两组细胞色素C和Caspase－3蛋白水平比较()

表2 两组细胞色素C和Caspase－3蛋白水平比较()

组别 胞核 胞浆单纯缺氧组TG2 siRNA缺氧组t值P值细胞色素C 31.6 ± 2.5 13.5 ± 2.3 5.174 0.023 Caspase－3 26.7 ± 1.8 12.6 ± 1.5 4.926 0.035细胞色素C 5.6 ± 0.4 17.9 ± 2.1 6.517 0.014 Caspase－3 4.9 ± 0.6 16.6 ± 1.5 6.238 0.016

3 讨论

TG2在胞浆、胞核、线粒体、细胞膜表面及细胞外基质中均有大量表达。TG2在Ca2＋依赖的催化蛋白交联活性，三磷酸鸟苷（GTP）依赖的G蛋白功能，蛋白二硫键异构酶活性和蛋白激酶功能表达方面均发挥重要作用[3]。此外，TG2在多种恶性肿瘤细胞的生物学行为中扮演重要角色。但目前针对TG2在细胞凋亡中的作用仍无统一看法。部分研究认为，TG2主要表现促凋亡功能。缺氧条件下细胞表达一系列高水平活性氧簇（ROS），进而促使大量Ca2＋进入细胞内，胞浆内钙超载，诱导TG2酶学活性增强，进而启动细胞凋亡程序的发生[4]。也有研究指出，TG2高表达并不与凋亡程度一致。肺癌、结直肠癌、肝癌等数个恶性增殖肿瘤细胞系在体外诱导TG2过表达后，细胞凋亡率并未明显增加[5]。Jang等[6]的研究证实，TG2发挥促凋亡作用可能与其水平有关，当TG2明显消耗降低后可导致细胞周期停止而进入凋亡。蔺会云等[7]研究指出，TG2表达升高可能促进肾癌细胞增殖，抑制凋亡。细胞核内聚集的TG2（R580A）可以抵消胞浆内TG2的促凋亡作用。因此，假设TG2在不同条件下可发挥促凋亡和抗凋亡双重作用，其倾向哪一方及作用强弱可能与细胞类型、作用条件及TG2在细胞内的定位和构型等不同有关[8]。本研究结果显示，缺氧条件下，胞核中TG2显著增多，而胞浆中变化不明显。TG2活性增强，mRNA和蛋白表达水平明显增加，随缺氧时间延长逐渐增高。单纯缺氧组胞核中TG2活性、蛋白及mRNA水平均显著高于TG2 siRNA缺氧组，差异有统计学意义，而胞浆中两组比较，差异无统计学意义。提示缺氧条件下胞核中TG2的表达可能参与抗凋亡过程，而胞核中TG2更多地参与促凋亡过程。

骨肉瘤细胞凋亡途径主要有2条，即死亡受体配体途径和线粒体途径。其中线粒体途径是细胞内主要的凋亡机制，具体过程为细胞受胞内外各种凋亡刺激因子作用，诱导线粒体释放细胞色素C，胞浆中细胞色素C与凋亡蛋白酶活化因子－1（Apaf－1）结合形成多聚体；进而趋化Caspase－9前体形成凋亡小体，Caspase－9激活后可进一步促进下游Caspase－3活化，加速凋亡进程[9]。Caspases－3是 Caspases家族介导细胞凋亡的关键分子，是各种凋亡途径的终末效应分子。胞浆中无活性状态的Caspases－3以酶原形式存在，凋亡启动的早期阶段即可被迅速、大量激活，活化状态的Caspase－3结构组成有2个大亚基和2个小亚基，作用底物分布在胞浆和胞核中，通过多种效应分子介导的信号转导途径，最终诱导细胞凋亡[10]。胡岳等[11]研究证实，TG2在促凋亡过程中，同样可以与细胞核、细胞质及线粒体内的一些蛋白形成非共价复合物，然后与Caspase－3形成不溶性复合物，进而抑制其活性，抑制凋亡进程的进一步扩大。其遏制凋亡发生及级联扩增是不依赖TG2转化酶功能，而可能与TG2的细胞定位与分子结构构象不同有关[12]。本研究结果提示，单纯缺氧组Caspase－3活性水平无明显增加，而siRNA转染缺氧组通过直接抑制 TG2表达水平，导致 Caspase－3活性及其蛋白相对表达水平显著升高，细胞凋亡率也随之上升。由此说明，细胞缺氧状态可诱导TG2的异常高表达，介导Caspase－3活性下降而发挥抗细胞凋亡表达[13]。

本研究中发现，单纯缺氧组胞核中细胞色素C和Caspase－3蛋白水平显著高于TG2 siRNA缺氧组，胞浆中含量及细胞凋亡率显著低于TG2 siRNA缺氧组，提示缺氧条件下TG2可抑制骨肉瘤细胞色素C和Caspase－3由线粒体向胞浆内释放，起到抗凋亡作用[14]。

综上所述，缺氧条件下TG2高表达有抑制MG－63骨肉瘤细胞凋亡的作用，可能与抑制胞核中细胞色素C和Caspase－3向胞浆中转移有关，可能成为治疗骨肉瘤的新干预靶点。下一步研究可在动物模型中进行验证。

参考文献：

[1]蔡文涛，夏 虹，沈宁江，等.Ⅱ型谷氨酰胺转氨酶对骨肉瘤MG－63细胞凋亡的抑制作用及其机制[J].吉林大学学报（医学版），2014，40（4）：782 － 789.

[2]王建新.TG2对缺氧条件下骨肉瘤MG－63细胞凋亡的影响[J].广东医学，2015，36（13）：1996 － 2000.

[3]Hsieh YF，Liu GY，Lee YJ，et al.Transglutaminase 2 contributes to apoptosis induction in Jurkat T cells by modulating Ca2＋homeostasis viacross－ linking RAP1GDS1[J].PLoSOne，2013，8（12）：e81516.

[4]Lee HJ，Lee CH.Transglutaminase 2 is involved in expression of osteoprotegerin in MG －63 osteosarcoma cells[J].Biomol Ther（Seoul），2013，21（3）：204 － 209.

[5]Cho SY，Lee JH，Bae HD，et al.Transglutaminase 2 inhibits apoptosis induced by calcium－overload through down－regulation of Bax[J].Exp Mol Med，2010，42（9）：639 － 650.

[6]Jang GY，Jeon JH，Cho SY，et al.Transglutaminase 2 suppresses apotosis by modulating caspase 3 and NF－kappaB activity in hypoxic tumor cells[J].Oncogene，2010，29（3）：356 － 367.

[7]蔺会云，陆应麟.组织型谷氨酰胺转氨酶在肿瘤生物学中的作用[J].军事医学科学院院刊，2006，30（4）：382 － 385.

[8]Nurminskaya MV，Belkin AM.Cellular functions of tissue transglutaminase[J].Int Rev Cell Mol Biol，2012，294（1）：1 － 97.

[9]王玉峰，王岩峰，胡春吉，等.NF－κB抑制剂PDTC对人骨肉瘤MG－63细胞凋亡及Livin和Caspase－9表达的影响[J].中国矫形外科杂志，2011，19（7）：589 －591.

[10]邓 超，曲国蕃.XIAP和Caspase－3在骨肉瘤中的表达及其意义[J].哈尔滨医科大学学报，2010，44（2）：156 － 159.

[11]胡 岳，王 涌，邱江锋.组织型转谷氨酰胺酶在肿瘤发生、发展、侵袭和转移中的作用及其作用机制的研究进展[J].肿瘤，2013，33（9）：831 － 836.

[12]Mehta K，Kumar A，Kim HI.Transglutaminase 2：a multi－ tasking protein in the complex circuitry of inflammation and cancer[J].Biochem Pharmacol，2010，80（12）：1921 － 1929.

[13]Kumar S，Mehta K.Tissue transglutaminase，inflammation，and cancer： how intimate is the relationship？[J].Amino Acids，2013，44（1）：81 － 88.

[14]李 梅，张 余.细胞凋亡与骨肉瘤[J].中国骨科临床与基础研究杂志，2011，3（4）：299 －303.