黄芩苷对LPS诱导流产小鼠母胎界面免疫微环境的影响

马雁南 ，杨小颀

（1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046； 2.宝鸡市第二中医医院妇产科，陕西 宝鸡 721300；3.陕西中医药大学第二附属医院生殖科，陕西 咸阳 712046）

妊娠是一个独特的生理现象，胎儿与母体间的免疫调节既矛盾又复杂[1]。胚胎中带有一半的父系抗原，作为一种半异己抗原，势必会激发母体的免疫应答，而遭到母体的排斥。但令人惊叹的是，正常妊娠并未出现排斥现象，恰恰相反，母胎间“和平相处”，这就是母胎免疫耐受。这一现象的形成机制格外复杂，包含多种免疫反应，免疫遗传以及子宫局部的免疫调节等。近年来随着生殖免疫研究的精准化深入，发现妊娠免疫耐受的形成与母胎界面局部的细胞因子保护内环境的稳态密切相关，其中，最为经典的是Th1/Th2细胞因子的平衡模式。Th1型细胞和Th2型细胞是由Th0分化而来的。Th1型细胞分泌的细胞因子包含IFN-γ、TNF-α、IL-2，可对胚胎造成免疫损伤。Th2型细胞分泌的细胞因子包含IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等，对胚胎起免疫保护作用。正常妊娠时母胎界面是以Th2型反应占优势的[2-6]。

黄芩初载于《本经》，其性凉味苦，具有清热安胎的作用[7]。中药安胎历史悠久，黄芩在诸多安胎方剂中出现，沿用至今，其安胎效果已被临床实践所证实[8]，但对其作用机制尚不明了。本实验选用LPS诱导流产小鼠模型，旨在研究黄芩是如何通过调节子宫局部母-胎界面免疫状态来发挥安胎作用，从免疫学角度探讨黄芩的安胎机理，为中医学中黄芩“清热安胎”理论提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及药品 细菌脂多糖（Lipopolysaccharide from E coli.O111B4），Sigma公司产品；黄芩苷（Baicalin），购于博奥生物医药科技有限公司；小鼠INF-γ、IL-4ELISA测试盒，BioSource产品；蛋白酶抑制剂（Aprotinin），Biosharp产品。1.2 试验动物 6～8周龄SFP级昆明雌鼠，体质量20～22 g（购于第四军医大学实验动物中心），饲养适应环境1周后，阴道涂片法挑选出处于动情期雌鼠，与雄鼠2:1合笼交配，次晨检出阴栓者，记为孕0 d。1.3 动物分组及处理 受孕小鼠随机分为正常对照组（A组）、LPS模型（B组）和黄芩苷治疗组（C组）。B、C组孕鼠分别于孕7 d给予尾静脉注射LPS 0.1 μg（0.2 mL）制作流产模型，A组孕7 d尾静脉注射PBS 0.2 mL。B组自孕4 d开始连续灌胃（磷酸盐缓冲液0.4 mL/d），共4 d；C组自孕4 d开始连续灌胃（黄芩苷液0.4 mL/（mg.d），共4 d。孕9 d处死所有孕鼠。

1.4 胚胎吸收率和流产率计算 孕9 d颈椎脱臼法处死孕鼠。打开腹腔，暴露子宫，观察子宫生长情况，记录胚胎着床数目和胚胎吸收数目。发育正常的子宫胚胎形状似串珠，色泽光鲜，大小均一，胚胎的中间部位可见红色条索状胎盘。而发育异常子宫呈黑紫或褐色，内可见陈旧性出血或伴血凝块，体积明显变小，部分胚胎萎缩或消失。解剖镜下观察，模糊一片无正常胚胎结构。胚胎吸收率及流产率的计算公式：胚胎吸收率=吸收胚胎数/（吸收胚胎数＋存活胚胎数）×100% 。流产率=流产母鼠数/试验组母鼠总数×100%

1.5 试验取样 在冰盒上完整取出子宫，除去系膜及脂肪组织后称重。纵向剖开子宫，完整剥离胚胎后称量子宫净重。剪下右侧子宫，称重后加入pH＝7.4磷酸盐缓冲液（内含6倍量0.75 μg/mg蛋白酶抑制剂），立即在低温环境中进行匀浆，4 ℃，12 000 r/min离心15 min。取上清液分装，- 80 ℃冻存，用于ELSIA测定IFN-γ、IL-4的含量。

1.7 统计学方法 所有数据使用Excel 2000和SPSS 13.0软件包进行统计，单变量方差分析组间差异显著性。试验数据以均数±标准差（）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组流产率比较 A组的流产率为20%，正常胚胎居多，胚胎组织新鲜，少见出血、坏死，胚胎吸收率为3.4%。B组中10只孕鼠均发生流产，子宫内无存活胚胎，部分胚胎已经溶化，流产率及胚胎吸收率均为100%，与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。C组的流产率为20%，胚胎吸收率为3.3%，近似A组，2组差异无统计学意义（P＞0.05），但与B组相比差异有统计学意义（P＜ 0.001）。说明LPS可致孕鼠发生流产，而黄芩苷能够对抗LPS致小鼠流产的作用，具有安胎功效。

2.2 对子宫重量的影响 3组之间比较，B组的小鼠除胚子宫的重量最小（0.043±0.021 5）g，与A、C组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。A组（0.110±0.017 8）g、C组（0.115±0.012 2）g，2组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 3组子宫组织中IFN-γ含量的变化 B组与A、C组相比，差异极显著，小鼠的子宫组织中IFN-γ含量明显升高（P＜0.01）。C组小鼠的子宫组织中IFN-γ的含量无明显升高，与A组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 对IL-4含量变化的影响 B组小鼠子宫组织中IL-4含量最低，与A、C组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；C组小鼠的子宫组织中IL-4含量最高，见表1。

表1 3组子宫组织匀浆中IFN-γ、IL-4的含量比较（，n = 10） pg/mL

表1 3组子宫组织匀浆中IFN-γ、IL-4的含量比较（，n = 10） pg/mL

注：与空白对照组比较，# P＜0.05，## P＜0.01

组 别 IFN-γ IL-4空白对照组 20.413±0.140 24.650±0.213细菌脂多糖组 65.647±0.380 ## 9.413±0.334#黄芩苷组 16.409±0.081 ## 38.179±0.134#

3 讨论

随着科技的突飞猛进，生殖免疫学家对于妊娠免疫耐受这一特殊的生理现象已转向精准研究。母胎界面微环境的稳定是否与细胞因子的免疫调节相关，已成为这一研究领域的热点。TAU GZ等[9]研究发现，正常妊娠孕妇体内的IFN-γ的含量显著降低，而IL-4的含量则明显增高。IFN-γ能增加Th1型细胞因子的活性，并可阻遏Th2型细胞的分泌，降低IL-4、IL-10的活性。与此同时，IFN-γ还阻止胎盘的发育及滋养细胞的增殖。而IL-4则是维系妊娠免疫耐受的关键因子，影响Th0细胞分化成为Th2细胞。研究[10]表明，如小鼠体内缺乏IL-4，则无Th2型反应，其流产率及胚胎吸收率也骤然上升。

细菌脂多糖诱导的流产小鼠是经典的流产动物实验模型，其致流产机制主要是影响孕鼠的免疫功能，通过活化Th1型细胞，释放大量的IFN-γ，刺激巨噬细胞分泌过量的TNF-α，放大子宫局部的细胞免疫效应，使母胎微环境中的Th1型细胞因子的整体水平上调，破坏Th1/Th2的平衡，使其偏向Th1型，致使流产发生[11]。

流产又称为“滑胎”“胎动不安”，中医认为，其病因多与母胎肾气不固、冲任亏损所致。肾藏精主生殖，为先天之本。肾气虚弱易导致滑胎或胎动不安。祖国医学认为，血热妄行、热壅气滞、血瘀阻滞可影响脾肾功能，进而导致胎动不安、滑胎。故需清热凉血，健脾补肾[12]。金元朱震亨曰“俗以黄芩为寒性而不敢用，盖不知胎孕宜清热凉血，血不妄行，乃能养胎”，并称其为“安胎圣药”。黄芩中的有效成分为黄酮类，包括黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷等[13]。大量生殖免疫研究发现，黄芩及其有效成分能够调节机体的免疫功能，尤其对妊娠期母-胎微环境的发挥着调节作用。张晓思[14]使用黄芩苷提前干预妊娠小鼠，观察着床期小鼠子宫微环境的变化，发现黄芩苷能够提升体内IL-10含量，降低IFN-γ含量，使小鼠子宫局部呈现Th2型反应。赖楠楠[15]研究发现黄芩苷能有效降低 URSA小鼠胚胎吸收率，调节母胎界面DC的功能变化，诱导母胎免疫耐受，治疗URSA。

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本试验中，给予黄芩苷提前干预治疗的LPS流产模型小鼠，其胚胎存活率高，并且胚胎组织新鲜，发育正常，色泽光滑红润，无瘀血、出血现象。流产率及吸收率明显低于LPS组（P＜0.01），子宫重量明显高于LPS组。子宫局部的IFN-γ含量最低，而IL-4含量最高，与LPS组比较，P＜0.01。试验数据显示，LPS致流产的机制可能是通过升高子宫局部的IFN-γ含量，降低IL-4的含量，使Th1/Th2比例偏向Th1反应，这与之前的研究报道相符合。而黄芩苷的作用恰好相反，其对抗LPS诱导的流产，阻碍IFN-γ的分泌，刺激IL-4的分泌，调节子宫局部免疫功能向着Th2占优势的平衡模式转变，具有良好的安胎效果。

参考文献：

[1]OZEN M, ZHAO H, LEWIS DB, et al. Hemeoxygenase and the immune system in normal and pathological pregnancies[J].Front Pharmacol, 2015(6):1-13.

[2]DEB K, CHATURVEDI MM, JAISWAL YK.A’minimum dose’of lipopolysaccharide required for implantation failure;assessment of its effect on the maternal reproductive organs and interleukin-1 alpha expression in the mouse[J].Reproduction, 2004, 128(1):87-97.

[3]WEGMANN TG,LIN H,GULIBERT L,et al.Bidirectional cytokine interactions in the maternal-fetal relationship: is successful pregnancy a Th2 phenomenon?[J].Immunology Today, 1993, 14(7):353.

[4]NAKAMURA N, HAYASAKE S, ZHANG XY, et al. Effects of baicalin, baicalein, and wogonin on interleukin-6 and interleukin-8 expression, and nuclear factor-kappab binding activities induced by interleukin-1beta in human retinal pigment epithelial cell line[J]. Exp Eye Res, 2003, 77(2):195-202.

[5]刘芳,罗颂平. Th1/Th2型细胞因子平衡调控对正常妊娠影响的研究进展[J].广州中医药大学学报, 2004, 21(3):231-233.

[6]顾青,韩霞.补肾安胎中药对先兆流产模型大鼠治疗机制的研究[J].吉林中医药, 2016, 36(3):298-300.

[7]高学敏.中医学[M].北京:中国中医药出版社, 2003:156.

[8]周旋,冯晓玲.基于文献研究的复发性流产病因病机及证治规律[J].长春中医药大学学报, 2015, 31(1):156-158.

[9]TAU GZ, VON DER WEID T, LU B, et al. Interferon γ signaling alters the function of T helper type I cells[J]. The Journal of Experimental Medicine, 2000, 192(7):977-986.

[10]SWAIN SL,WEINBERG AD. English M IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors [J]. Immunol,1990(145):3796.

[11]CLARK DA, MANUEL J, LEE L, et al. Ecology of dangerdependent cytokine-boosted spontaneous abortion in the CBA*DBA/2 mouse model.I.Synergistic effect of LPS and(TNF-alpha+IFN-grmma) on pregnancy loss[J].Am J Reprod Immumol, 2004, 52(6):370-378.

[12]李瑞玲,陆启滨.从五脏与血瘀论治滑胎[J].长春中医药大学学报, 2014, 30(6):1076-1078.

[13]郑学威.黄芩的炮制及临床效用分析[J].上海中医药杂志,2013, 47(9):65-73.

[14]张晓思.黄芩苷对着床期小鼠子宫保护研究[D].保定:河北农业大学, 2010.

[15]赖楠楠.黄芩苷调节DC亚群分化与功能治疗URSA作用与机制研究[D].济南:济南大学, 2016.