靶向DNA感受器佐剂研究进展

陈 靖，田 源，白国辉,2*

(1.遵义医学院医学与生物研究中心,贵州遵义 563000; 2.贵州省高等学校口腔疾病特色重点实验室,贵州遵义 563000; 3.遵义医学院附属口腔医院，贵州遵义 563000)

DNA感受器位于细胞浆内，类似于模式识别受体，能快速识别病原体迅速激活固有、适应性免疫应答。已有研究表明一些DNA感受器可以作为基因疫苗佐剂应用。DNA代谢的副产物类似于病原相关分子模式，来自死亡细胞的遗传物质可以作为佐剂改善基于蛋白质的疫苗的免疫原性。近年来发现DNA质粒及其代谢产物可作为抗原直接与DNA感受器相互作用，进入细胞胞质的DNA(被机体认为是一种病原体感染的危险信号)可以被DNA感受器识别、结合，快速激活固有免疫应答在成纤维细胞、巨噬细胞和树突状细胞中诱导产生大量的Ⅰ型干扰素(IFN)，增强DNA疫苗的免疫效应[1]。本文对国内外关于DNA感受器(DDX41，cGAS，ZBP1/DAI，RIG-I，MDA5，HMGB，IRF-1)、DNA质粒的代谢产物及其类似物(c-diGMP，DMXAA，CMA)作为佐剂的最新研究进展做一综述。

1 DNA感受器作为佐剂

1.1 DDX41

DDX41是解旋酶DEXDc家族的成员。作为细胞质DNA传感器，识别细胞质DNA、病毒DNA、细菌第二信使c-di-GMP通过DEAD结构域与STING结合通过激活STING-TBK1-IRF3信号通路诱导产生Ⅰ型干扰素[2]。DDX41能通过与CDN(cyclic dinucleotides)的结合诱导Ⅰ型干扰素的产生[3]。Lazarte J M等[4]将DDX41作为佐剂构建疫苗(pEF-GD)免疫橄榄比目鱼，发现通过加入分子佐剂DDX41，诱导产生Ⅰ型干扰素增强了适应性免疫应答，提高了比目鱼的存活率。

1.2 cGAS

cGAS(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase)是通过产生第二信使cGAMP(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate)诱导干扰素的细胞溶质DNA传感器[5]。哺乳动物细胞中的cGAS被入侵宿主细胞的细菌性或病毒性DNA激活，通过将DNA中GMP、AMP催化形成cGAMP激活STING相关的下游免疫信号通路，产生干扰素以及其他细胞因子[6]。研究显示，来自cGAS缺陷型小鼠的细胞(包括成纤维细胞，巨噬细胞和树突状细胞)在DNA转染或DNA病毒感染时不能产生Ⅰ型干扰素和其他细胞因子，表明cGAS是胞质DNA传感器[7]；cGAS是一种潜在佐剂，可通过诱导产生Ⅰ型干扰素激发先天性免疫反应[8-9]。

1.3 ZBP1/DAI

Z-DNA结合蛋白1(ZBP1)也被称为干扰素调节因子激活物(DAI)或DLM-1，其直接结合dsDNA并增强其与IRF3和TBK1的结合，DAI(DLM-1/ZBP1)在小鼠成纤维细胞中的表达选择性增强了DNA介导的Ⅰ型IFN和其他参与先天免疫因子的产生[10]。采用电穿孔法将携带肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens，TAAs)DNA联合DAI基因(作为佐剂)的质粒接种于小鼠体内，发现促进有效的抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞产生，因此，显示ZBP1/DAI在DNA疫苗具有佐剂的性质[11]。

1.4 RIG-Ⅰ

视黄酸诱导型基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)poly(dA-dT)通过RNA聚合酶Ⅲ转变为RNA(即5′-三磷酸RNA)，诱导Ⅰ型IFN产生[12]。虽然RIG-Ⅰ是细胞溶质RNA受体，但RIG-Ⅰ敲低与dsDNA诱导的Ⅰ型IFN减少相关，因此，是感染病毒核酸诱导Ⅰ型IFN的先天免疫激活的细胞溶质DNA感受器[13-14]。构建以RIG-Ⅰ为佐剂的DNA疫苗，结果显示疫苗效诱导Ⅰ型IFN产生并提高流感特异性血清抗体水平[15]。即使在低抗原剂量下，RIG-Ⅰ通过STING途径的激活也可以诱导增强适应性免疫应答，这表明RIG-Ⅰ可作为有效的DNA疫苗佐剂。

1.5 MDA5

RIG-Ⅰ样受体家族的重要成员MDA5(黑素瘤差异化相关基因5)，较 RIG-Ⅰ具有更强诱导产生Ⅰ型IFN反应的能力[16]。将chMDA5的N-末端片段[chMDA5(1-483)]结合H5N1的血凝素(HA)形成共表达质粒免疫鸡群,结果显示与单独的HA DNA接种相比，chMDA5(1-483)辅助的HA DNA疫苗诱导更强的免疫反应，MDA5可作为有效的DNA疫苗佐剂加以应用[17]。

1.6 HMGB1

高迁移率组蛋白B1(HMGB1)位于细胞核中，它不仅直接与DNA结合且招募其他蛋白质形成DNA-HMGB1复合物，可作为DNA调节器,HMGB1可以识别并结合外源性核酸，诱导产生Ⅰ型IFN，激发固有免疫反应[18]。

将HPV16 E7作为抗原和HMGB1作为佐剂构建DNA疫苗免疫小鼠，HMGB1以及其衍生短肽HP91可作为HPV疫苗的佐剂，用于改善HPV DNA疫苗的免疫原性[19]。

1.7 IRF-1

IRF-1是诱导干扰素表达蛋白中的转录调控因子家族中的一个成员，其与IFN及IFN诱导性基因中的顺式作用元件结合，调控Ⅰ型IFN及相关基因的表达[20]。将IRF家族(IRF-1，IRF-3和IRF-7)的转录因子作为HIV-1 DNA疫苗的佐剂免疫Balb/c小鼠，发现只有IRF-1增强了抗原特异性免疫应答，因此IRF-1可作为DNA疫苗接种的佐剂[21]。DNA感受器作为识别受体与结合外来抗原,通过共同的STING-IRF3-IFN信号通路诱导IFN干扰素的产生而到达类似免疫佐剂增强免疫反应的作用。

2 DNA质粒代谢物作为佐剂

2.1 c-diGMP

环状二-GMP(c-diGMP)是由细菌合成的小核苷酸第二信使。环二核苷酸 c-di-GMP、c-di-AMP 可以通过直接与STING(作为DNA感受器)的作用诱导产生Ⅰ型干扰素,当c-diGMP转染哺乳动物细胞时,利用与dsDNA相同的信号途径通过直接结合STING并激活下游TBK1-IRF3信号,诱导高水平的Ⅰ型IFN[22]。向Balb/c小鼠鼻内接种NIBRG-14(H5N1)血凝素(HA)和c-di-GMP(作为佐剂)构建的疫苗，发现c-di-GMP诱导更多病毒特异性CD4+T细胞产生，增强了疫苗的免疫效果[23]。表明c-di-GMP作为佐剂可以诱导Th1细胞反应增强，细胞因子升高。

构建疫苗通过激活c-di-GMP可抑制小鼠B16黑素瘤的免疫原性提高抗肿瘤作用，说明c-di-GMP是有效的疫苗佐剂[24]。

2.2 DMXAA

DMXAA，即5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸，是一种合成小分子化合物，是一种强有力的Ⅰ型IFN诱导剂。DMXAA参与TBK1-IRF3信号通路诱导Ⅰ型IFN产生。将其作为佐剂与OVA(作为抗原)免疫小鼠，证明与单独OVA疫苗相比，其通过TBK1-IRF3信号轴产生Ⅰ型IFN，诱导更强且持久的特异性免疫反应。

2.3 CMA

抗病毒化合物10-羧甲基-9-吖啶酮(CMA)是一种有效的通过STING-TBK1-IRF3通路的Ⅰ型IFN诱导剂。

3 结语

国内外研究者多次利用DNA疫苗进行了针对感染性疾病(如流感、乙型肝炎、艾滋病和疟疾等)和非感染性疾病(如非病毒性癌症等)的人类临床试验，但比在其他哺乳动物中观察到的免疫原性更低。为改善DNA疫苗的免疫原性进行的研究已经表明，理解DNA疫苗的作用机制可能是成功改善其免疫原性的关键。研究者们目前的理解是DNA疫苗以两种方式诱导先天和适应性免疫应答，第一种方式是通过DNA质粒编码的蛋白质(或多肽)抗原可以在基质细胞(即，肌肉细胞)以及DC中表达，这些抗原被加工通过直接或交叉呈递给幼稚的CD4或CD8T细胞。第二种方式是转染的DNA质粒及其代谢物(例如cGAS，c-diGMP)与DNA感受器相互作用并激活STING-TBK1-IRF3途径产生Ⅰ型IFN、前炎性细胞因子等激活并启动适应性免疫应答[25]。

传统的佐剂可能产生某些不良反应。理想的佐剂应该不仅具有增强免疫应答的作用，而且生物安全性较好。理想的佐剂应该不仅可以诱导较强和持久的免疫应答，而且要尽量减少其对机体的不良反应。新型DNA感受器佐剂不仅可以通过快速激发固有免疫以刺激更强的适应性免疫应答提高了免疫反应的强度，而且DNA质粒的代谢产物及DNA感受器作为信号分子佐剂安全性较好，符合新型佐剂对生物安全性要求高的标准。

深入研究DNA感受器分子特征、免疫功能及其信号转导机制，其与DNA质粒的相互作用的机制对于揭示DNA疫苗的免疫机制、提高疫苗的效应和研发分子佐剂具有重要意义。截至目前，除文中讨论的信号分子作为基因佐剂外,对于已证明是DNA传感器的黑色素瘤缺乏因子2(AIM2),γ干扰素诱导蛋白16(也称为p204),STING(最有潜力的DNA感受器,几乎参与所有胞内B型dsDNA模式识别受体介导的IFN-β通路)。作为佐剂性质的研究尚未见国内外的相关报道。DNA感受器及其代谢产物作为佐剂的研究为理想佐剂的研制开拓出一条新的思路，为DNA疫苗的分子设计提供新的思路和应用前景。

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