澳门地区鸡源产气荚膜梭菌的污染情况及基因分型

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产气荚膜梭菌是一种在自然界具有广泛的分布，在土壤、食物、饲料、污水、粪便中均有生长，是人畜肠道中正常菌群之一[1]。能引起人类食物中毒、相关性腹泻和动物腹泻等疾病的重要病原菌。症状通常为下痢(带血腹泻)与腹痛，偶尔伴随恶心、呕吐与发烧，病发期通常为10 h～12 h，患者通常可于24 h～48 h内康复，绝少引发致命疾病，但对于小孩、老人、及免疫力差的人，会较易出现严重及持续症状[2]。可惜在澳门地区公共卫生常规检测项目中，除罐头食物以外，其它食品并没有进行常规检测，有关此菌的研究资料更是缺乏。因此本研究进行此菌的分离鉴定和基因分型调查，分析食品中产气荚膜梭菌的污染情况以及其基因型分布。

1　材料与方法

1.1样本采集从本澳的传统市场及超级市场中购买60个鸡肠、30个新鲜鸡及30个冰鲜鸡样本，总样本量为120个。如8 h内不能进行检验，应以无菌操作称取25 g样本加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液，并尽快置于-80 ℃低温冰箱中冷冻保存[3]。

1.2菌株阳性菌株：产气荚膜梭菌A型(NCTC 8327)由澳门理工学院高等卫生学校保存，产气荚膜梭菌B型(NCTC 13110)、产气荚膜梭菌C型(NCTC 8081)、产气荚膜梭菌E型(NCTC 8084)等菌购自英国公共健康实验中心国家标准菌株库。 阴性菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 29213、大肠埃希氏菌ATCC 25922、粪肠球菌标ATCC 29212、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、化脓性链球菌 ATCC 19615、普通变形杆菌ATCC 13315、蜡样芽孢杆菌ATCC 11778等菌由澳门理工学院高等卫生学校保存。

1.3培养基和试剂甘油-氯化钠溶液购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，蛋白胨水、蛋白胨—亚硫酸盐—环丝氨酸培养基(TSC)、D-环丝氨酸购自OXOID公司，血培养基(5%羊血)购自BIOMERIEUX公司，酸性磷酸酶试剂购自SIGMA公司，multiplex PCR试剂盒购自Qiagen公司。

1.4细菌分离与鉴定采集样品的处理均按国标方法进行[3]。吸取10-1的稀释检液1 mL，然后加入9 mL TSC，制成10-2的检测样本。再制成10-3的检测样本。在42 ℃经双套管法培养6 h～8 h后，观察是否有黑色菌落生成，计数生长多少黑色菌落选取5个菌落再接种在5%羊血培养基，经24 h厌氧培养，观察菌落是否带有双溶血环，再挑选该菌落选已滴加酸性磷酸酶试剂的滤纸中涂开，等待2～3 min，呈现紫色视为产气荚膜梭菌阳性。

1.5DNA模板的制备利用经生化鉴定后菌株加入100 μL无菌水制作菌液，于沸水浴中加热10 min后，用1 630×g离心10 min后提取上清液。

1.6鉴定分离菌株的基因分型

1.6.1multiplex PCR引物购自Ivitrogen公司的6对引物，引物序列见表1。

1.6.2multiplex PCR反应体积为25 μL，包括：2× PCR Mix 12.5 μL；引物混合物2.5 μL；样本DNA 2 μL；蒸馏水补足至25 μL。混匀后开始进行PCR扩增，PCR反应条件为94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共进行35个循环，最后72 ℃ 延伸7 min[4]。PCR反应结束后，用100by-III DNA标志物作为分子量参照，在1.8%琼脂糖凝胶中 100 V电泳，80 min，在ChemiDoc 影像系统观察并记录结果。

1.6.3multiplex PCR专一性测试按照1.5和1.6.2的方法，对1.2中的阳性菌株与阴性菌株进行multiplex PCR扩增，评定multiplex PCR的专一性。

2　结　果

2.1产气荚膜梭菌分离与生化鉴定产气荚膜梭菌为革兰氏阳性，短粗的梭状芽孢杆菌；在TSC中形成黑色菌落；在5%羊血培养基中出现双溶血环的特征；在酸性磷酸酶试剂中，呈现紫色。从60个鸡肠样本中分离得到30株 (50%)；从30个新鲜鸡样本中分离得到10株 (33.33%)；从30个冰鲜鸡样本中分离得5株 (16.67%)。

表1扩增产气荚膜梭菌的六种主要毒素基因的引物序列
Tab.1Primer used to amplify six toxin genes of Clostridium perfringens

基因Gene引物序列5′⁃3′Primersequences5′⁃3′产物长度Productsize(bp)参考文献ReferencecpαGCTAATGTTACTGCCGTTGA324[5]CCTCTGATACATCGTGTAAGcpβ1GCGAATATGCTGAATCATCTA196[5]GCAGGAACATTAGTATATCTTCεtxGCGGTGATATCCATCTATTC655[5]CCACTTACTTGTCCTACTAACιAACTACTCTCAGACAAGACAG446[5]CTTTCCTTCTATTACTATACGcpeGGAGATGGTTGGATATTAGG233[5]GGACCAGCAGTTGTAGATAcpβ2AGATTTTAAATATGATCCTAACC567[6]CAATACCCTTCACCAAATACTC

2.2产气荚膜梭菌基因分型经电泳鉴定，45 株产气荚膜梭菌均扩增出大小约为 324 bp 的特异性条带，未扩增出针对cpβ1、εtx、ιA、cpe和cpβ2的条带，说明45株产气荚膜梭菌均为 A型，见图1。

1.100 bp DNA Marker；2.Blank；3.C.perfringens NCTC 8327；4.C.perfringens NCTC 3626；5.C.perfringens NCTC 8084；6.C.perfringens NCTC 8081；7-10.Sample Isolates图1　产气荚膜梭菌分离株的mPCR基因分型方法检测结果Fig.1　Multiplex PCR detection of isolated C.perfringens

2.3mPCR专一性测试4株标准产气荚膜梭菌均能扩增出相应毒素基因的片段，大小分别为： NCTC 8327 约为 324 bp；NCTC 13110为 196 bp、324 bp和655 bp；NCTC 8081为196 bp、 233 bp和324 bp；NCTC 8084 为324 bp、446 bp和567 bp。而阴性对照均未扩增出相应 的片段。说明mPCR 的专一性良好，见图2。

1.100 bp DNA Marker；2.C.perfringens NCTC 8327；3.C.perfringens NCTC 3626；4.Clostridium perfringens NCTC 8084；5.C.perfringens NCTC 8081；6.Blank；7.Escherichia coli ATCC 29213；8.Staphylococcus aureus ATCC 25922；9.Enterococcus faecalis ATCC 29212；10.Salmonella typhimurium ATCC 14028；11.Streptococcus pyogenes ATCC 19615；12.Proteus vulgaris ATCC 13315；13.Bacillus cereus ATCC 1177图2　mPCR专一性测试结果Fig.2　Result of specificity test of multiplex PCR

3　讨　论

产气荚膜梭菌并非动物肠道的优势菌群，其菌量相对较少[7]，因此当检出率很高时，可能是在屠宰过程中的交叉污染，以及处理的卫生条件较差所致。本次研究共检出45株产气荚膜梭菌(37.5%)，60个鸡肠样本检出率占50%，与国内外文献报导普遍高于60%的检出率相比[8-9]，本研究鸡肠样本的检出率亦相对偏低，这可能与本澳在鸡只屠宰后会反复清洗其内脏再出售有关。30个新鲜鸡 (33.33%)和30个冰鲜鸡样本(16.67%)中，与邻近地区广州的检出率68.6%比较[10]，相对较低；虽然澳门地区鸡只来源于内地，预期结果与内地接近，但检出率仍较广州的结果低，这可能与鸡只的屠宰处理过程中较规范，所引致的污染较低有关。

在A至E型的产气荚膜梭菌中，对人类有致病性只有A型及C型，以A型最为常见，本研究所有分离株均为具有致病性的A型，表示从市面出售的鸡肠、新鲜鸡及冰鲜鸡如没有彻底煮熟，于进食后有出现食物中毒的风险。

从本实验的结果比较，新鲜鸡的检出率较冰鲜鸡多出一倍，说明在冰鲜鸡的屠宰及冷却等处理过程中所造成的污染相对较少。由于澳门地区最近已经全面以冰鲜鸡代替新鲜鸡供应澳门地区市场，当中除了禽流感为考虑因素外，其它的致病菌亦不能忽视，本次研究正好为产气荚膜梭菌，在新鲜鸡及冰鲜鸡上的污染程度所致的公共卫生问题提供了参考数据。

参考文献：

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