中缅树鼩自然感染五种高致病性人腺病毒的血清流行病学分析

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人腺病毒于1953年首次从手术切除的儿童腺体和扁桃体内分离、鉴定，可感染呼吸道、泌尿生殖道及眼角结膜等多种粘膜组织，引起多种疾病甚至死亡[1]。目前腺病毒已有A-G共7种68个腺病毒型别。其中B组人3、7、11、14、55和E组4型腺病毒是引起重症致死性肺炎的主要病原体[2]。由于人腺病毒具有严格的宿主专一性，在常用的模型动物体内并不感染和复制，目前国内外仍无其疾病动物模型，因此人B组腺病毒感染相关的致病机制，尤其是致重症机制，以及不同型病毒间的重组机制等仍不清楚，亟待研究。

中缅树鼩属哺乳纲，有胎盘类，攀鼩目，树鼩科，我国云南、广西、广东、海南岛均有分布。树鼩与灵长类亲缘关系接近，其解剖结构、生化代谢及基因组方面与人具有较高的相似度，远高于鼠、犬、猪等常用实验动物，因此被认为是灵长类最亲密的近亲[3]。中国对树鼩的研究早见于教研学和动物学方面，1975年首先进行医学上的尝试，用于代替恒河猴作为小儿麻痹方面的实验。近年来，昆明动物研究所对树鼩进行了全基因组测定和解析工作，为树鼩应用于医学生物学方面提供了理论依据[4]。陈元鼎等人从树鼩粪便中检出具有低滴度的凝聚人O型、B型红细胞的腺病毒，但至今仍未确定树鼩易感人源腺病毒[5]。鉴于树鼩已证实可感染多种人源病毒，如多种肝炎、轮状、疱疹、棒状、副粘[6-8]，而且人腺病毒研究正困于缺乏合适的动物模型，将树鼩应用于人腺病毒动物模型的建立是一个良好的研究方向。

为了探讨树鼩存在自然感染人腺病毒的可能性及分型，本实验测定树鼩血清对B组人Ad3、Ad7、Ad14、Ad55和E组人Ad4的中和效价水平，进而为后续探索人腺病毒的树鼩动物实验模型的建立提供依据。

1　材料与方法

1.1实验动物及标本采集树鼩购于昆明医科大学实验动物中心，雌雄各半，年龄均>6月龄，于P2动物实验室恢复性饲养1周后进行实验。于树鼩腿静脉处采集0.5 mL无抗凝血，采集后对待测血液标本编号，共34份样本。将血液标本在4 ℃冰箱内静置1 h，3 500 r/min离心5 min，收集血清，-80 ℃保存。

1.2病毒和细胞系人293细胞系为本实验室保存。实验中使用的人腺病毒Ad3(GenBank：DQ099432)、Ad4(GenBank：KF006344)为本实验室分离和保存；Ad7(GenBank：JX625134.1)为重庆医科大学附属儿童医院惠赠；Ad14(GenBank：JQ824845.1)为南方医科大学张其威教授惠赠；Ad55(GenBank：KF911353.1)为中国科学院生物医药与健康研究院陈凌研究员惠赠。病毒在293细胞增殖，并经氯化铯密度梯度离心法纯化，测定TCID50，-80 ℃保存。

1.3试剂PBS、DMEM培养基、胎牛血清、100×细胞培养用青霉素、链霉素、0.25%含EDTA胰酶购自GIBCO公司。42.23%和22.39%氯化铯溶液(pH=8.0)为自行配置。

1.4实验方法

1.4.1病毒微量血清中和试验参照中华人民共和国卫生行业标准(WS214-2008，附录B：微量中和试验操作步骤)和相关文献[9-11]，采用固定病毒稀释血清的方法进行。待测血清标本56 ℃灭活30 min，以除去可能存在的非特异反应物。灭活后血清标本40 μL用DMEM从1∶16开始作倍比稀释(从24-210)，即所产生的稀释倍数为1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1 024。根据所测滴度，用病毒维持液(含2%血清的DMEM)将病毒稀释为200 TCID50。取稀释好的待测血清及阳性血清与病毒稀释液等量混合(病毒稀释液终浓度为100 TCID50)。设定细胞对照、病毒对照组，将阴性对照混合液、阳性对照病毒混合液、血清对照混合液、待测血清病毒混合液及病毒工作滴度检查混合液置于37 ℃水浴作用1 h。最后接种至前1 d预先铺满239细胞的96孔培养板中，置37 ℃、5% CO2湿温培养箱孵育l h，弃去接种物，加入细胞维持液继续培养，培养3 d后，于显微镜下观察细胞病变，读取结果。

以病毒对照组为对照，待检样品可保护50%细胞的为阳性样品，其保护50%细胞的最高稀释度为该样品的中和效价。

1.4.2数据处理计数资料统计描述给出频数和百分比。SPSS 19.0进行统计分析，Fisher确切概率法检验血清中和抗体等级分布，P≤0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.15种腺病毒血清抗体阳性树鼩情况中和抗体出现于病毒感染的较早期，在体内的维持时间较长，动物体内中和抗体水平的高低，可显示动物抵抗病毒的能力，作为判断动物是否感染过该种病毒的指标。结果显示，共有21份树鼩血清对5种主要流行的人腺病毒中的一种或多种具有中和作用，发挥保护细胞的作用，其中Ad14中和抗体的检出阳性率最高，为55.88%(19/34)，Ad3和Ad55的阳性率也较高，分别为47.06%(16/34)和29.71%(10/34)，见表1。21份阳性样品中，有6份为单价抗血清，14份为多价血清，见表2。

2.2树鼩抗血清样本中和效价水平21份树鼩阳性抗血清根据抗体种类及水平排序，见表3。阳性血清主要表现为Ad3、Ad14和Ad55的混合型多价抗血清。Fisher确切概率法检验血清中5种型别的中和抗体水平具有统计学差异(P≤0.05)，其中Ad3与Ad4、Ad4与Ad14、Ad7与Ad14的中和效价等级构成具有统计学差异(P≤0.005)，中和Ad3与Ad14的抗血清效价较高，见图1。

表1树鼩抗血清中不同型别人腺病毒中和抗体阳性率
Tab.1Positive rate of different type adenovirus antibody in tree shrews antisera

病毒型别Virustype阳性数(份)Samplesize阳性率(%)PositiverateAd31647．06Ad438．82Ad7514．71Ad141955．88Ad551029．71

表2树鼩中不同血清型中和抗体混合情况
Tab.2Mixture of different type adenovirus antibody in tree shrews antisera

中和抗体混合种类Numberofmixtures例数Samplesize百分比(%)Percentage01338．241617．652514．713411．764514．71512．94

表321份树鼩阳性抗血清样本的中和效价(1∶χ)
Tab.3Neutralizing titer of 21 positive serum samples

No．Ad3Ad4Ad7Ad14Ad55110246464256128251216-128323102432-32324256-12832325512-16128326128-16326471024--128328256--322569128--64321032--16161132--16-1232--16-1332--16-1432--64-1532--16-16128----17--16--18---16-19---16-20---16-21---16-

图1　不同型别的血清中和效价分布Fig.1　Neutralizing titer statistics of positivesamples

3　讨　论

有研究报道以棉鼠、仓鼠、CBA小鼠、FVB/n小鼠为实验动物建立人腺病毒感染动物模型，但大部分是基于人5型腺病毒的研究，很少见其它型别的人腺病毒感染动物模型研究报道[9-13]。人5型腺病毒大剂量时可以感染这些动物模型并引起肺炎，但多表现出自限性，病毒在几天内即被清除干净。相对于人5型、2型等C组腺病毒感染，人3型、7型、11型等B组腺病毒感染常导致更严重的肺炎，也可能并发心肌炎、肾炎等[14]。因为3、7型等B组腺病毒感染的受体(桥粒芯蛋白-2，DSG-2)与5型腺病毒(CAR)不同，具有不同的组织嗜性[15]，所以这些用于人5型腺病毒研究的动物模型可能不适合其它型别腺病毒感染研究，人3型、7型、11型、21型、55型等相关型别的腺病毒感染动物模型还需要系统性的研究。本研究小组前期也利用人3型、4型和55型腺病毒对小鼠、裸鼠、金黄地鼠等啮齿类动物进行了攻毒实验，发现病毒并不在细胞中复制增殖，感染动物后呈一过性感染，动物无明显症状表现，表明上述动物不适合作为人B组腺病毒的感染动物模型。

树鼩作为一种新型的实验动物，在当今医学生物学(特别是病毒学)研究中发挥了越来越重要的作用。韩建保等人用酶联免疫法检测272份树鼩血清中人腺病毒IgG抗体，结果无阳性样品[16]。在本研究中，我们采用微量中和实验的方法来测定树鼩血清中的人腺病毒抗体，该方法是检测宿主过往感染史的经典方法，与常用的酶联免疫法等检测方法相比更具有优势：1)特异性更强，不存在交叉反应。微量中和实验法检测血清中的抗人腺病毒中和抗体，是目前仍在沿用的腺病毒血清型分型法的标准方法，各型别之间无交叉中和反应；而ELISA法检测对象是血清中存在的多克隆抗体，在动物腺病毒和人腺病毒之间可能存在交叉反应，影响结果的特异性。2)准确性更高，可用于病毒分型，明确树鼩过往感染的人腺病毒型别，并可进一步明确同一动物多次感染不同型别病毒的感染史。

本实验对34份树鼩抗血清样本进行5种腺病毒的中和试验，结果显示21份样本显阳性，树鼩血清大部分为多价抗血清，主要表现为和Ad3、Ad14和Ad55混合型多价抗血清。我国时有B组人腺病毒疫情暴发，血清型以3、7型为主，而新发致急性呼吸道疾病的14型和55型自首次暴发后每年均有新增个案，且疾病程度严重[2,11,17-24]。主要流行型Ad3和近年来在人群中新发的Ad14和在树鼩血清中的中和抗体检出率和效价较Ad55和Ad7的高，E组Ad4的阳性率和中和效价较低，提示人腺病毒在树鼩中的流行情况与在人群中暴发情况有着相关性。树鼩种群中存在人腺病毒流行，是潜在的人腺病毒动物模型候选，以树鼩为实验动物建立人腺病毒感染模型具有较大的可能，后续可深入探讨。

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