云南省永善县恙虫病流行病学调查

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恙虫病(tsutsugamushi disease)又名丛林斑疹伤寒(scrub typhus)，是由恙虫病东方体(Orientiatsutsugamsushi)引起的以鼠类为主要传染源和恙螨幼虫叮咬传播的一种自然疫源性疾病[1-2]。临床表现以发热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大为主要特征，严重者可多器官损伤，甚至死亡[2-3]。恙虫病在全球广泛流行，主要分布于亚洲太平洋沿岸的热带及亚热带地区，包括中国、韩国、印度、斯里兰卡、泰国、印度尼西亚、菲律宾、澳大利亚等国家[4]。我国恙虫病多发生于东南、西南地区及沿海岛屿[5]。近年来，我国恙虫病病例逐渐增多、疫区范围不断扩大、流行强度不断增加[6]。云南省位于我国西南边陲高原山区，与缅甸、老挝、越南接壤，地理环境复杂多样，以热带和亚热带气候为主，是恙虫病流行的主要省份[6]。云南恙虫病主要分布滇西和滇南部，而滇东北地区少见报告[7]。滇东北地处云南北部金沙江流域，地形和气候复杂，恙虫病媒介恙螨群落复杂多样[8]，但该地区恙虫病发生和流行的研究较少[9]。为了解滇东北恙虫病发生及流行状况，2015年1-12月笔者在滇东北永善县进行了恙虫病流行病学调查。

1　材料与方法

1.1样本来源2015年10月在云南省永善县耕地采用鼠夹诱捕法捕鼠，现场无菌解剖取鼠脾脏，置液氮保存。收集到永善县2015年1-12月疑似恙虫病发热患者(发热≥3 d，1-3周内有野外活动或田间劳作史，身体有焦痂/溃疡、皮疹和/或淋巴结肿大)血清，置-80 ℃冰箱保存。

1.2病例资料依据《恙虫病预防控制技术指南(试行)》[10]中恙虫病流行病学个案调查表对疑似恙虫病病例进行个案调查。

1.3主要试剂与仪器DNA提取试剂盒(Qiagen公司)、2×EasyTaq PCR SuperMix试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)、胶体金法恙虫病东方体抗体检测试剂盒(厦门市波生生物技术有限公司，Lot: H15102903)、DNA Marker DL2000(大连宝生物公司)、MM400 组织研磨仪 (德国Retch公司)、T Professional PCR仪(德国Biometra公司)。

1.4胶体金免疫试验参照胶体金法恙虫病东方体抗体检测试剂盒说明书操作，对病人血清做恙虫病东方体IgG和IgM抗体检测。

1.5巢式PCR检测用MM400 组织研磨仪研磨鼠脾样品，并应用Qiagen DNA试剂盒提取总DNA，采用文献[11-12]中的引物及条件对DNA样本做groEL基因扩增。PCR反应总体积为25 μL,应用2×EasyTaq PCR SuperMix试剂盒进行2次PCR扩增，并设阴性对照。第1次扩增时取2 μL DNA样本为模板，第2次扩增时取第1次扩增产物1 μL为模板。取第2次PCR产物(5 μL/孔)在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，扩得的恙虫病东方体目的基因片断大小为364 bp。

1.6DNA序列测定及分析PCR阳性产物送上海生工生物工程股份有限公司测定DNA序列。将所得序列在美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)网用Blast等对序列进行同源性比较，并用MEGA6.06软件Neighbor-joining法(Bootstrap值设定为1000)将相关恙虫病东方体菌株groEL基因片段序列构建系统发育进化树。

2　结　果

2.1胶体金法检测共收集发热病人血清34份，对这些血清做恙虫病东方体抗体检测，结果阳性24份(70.59%)，其中IgG阳性10份(29.41%)，IgM阳性21份(61.76%)。IgG或IgM单阳性分别为3份和14份，IgG和IgM均阳性7份。

2.2恙虫病病例诊断参照恙虫病预防控制技术指南[10]，依据患者流行病学史(流行季节，发病前3周到过恙虫病流行区，并有野外活动史)、临床表现(发热、淋巴结肿大、皮疹、焦痂或溃疡等)和实验室检测结果(恙虫病东方体抗体检测阳性、核酸检测阳性或分离到病原体)进行综合分析与诊断。在34例恙虫病患者中，实验室确诊病例21例(IgM阳性)，临床诊断病例13例(有恙虫病相关流行病学史、发热、焦痂/溃疡或/和皮疹)。

2.3流行病学资料在2015年5-10月共发现恙虫病34例，其中8月发病最多(32.35%)，其次7月(29.41%)和9月(14.71%)。发病年龄在2～72岁(中位数40.5岁)，40～49岁患者最多(32.35%)，其次30～39岁(17.65%)和2～9岁(14.71%)。其中，农民30例(79.41%)、散居儿童5例(14.71%)、学生2例(5.88%)，男与女性别比为17/17(表1)。

表1永善县恙虫病患者的发病季节与年龄分布
Tab.1Seasonal and age distribution of scrub typhus patients in Yongshan County

年龄(岁)病例数(%)月份(月)病例数(%)<105(14．71)1—40(0．00)10～2(5．88)52(5．88)20～3(8．82)62(5．88)30～6(17．65)710(29．41)40～11(32．35)811(32．35)50～4(11．76)95(14．71)60～1(2．94)104(11．76)>702(5．88)11—120(0．00)

2.4发病情况34例恙虫病患者均有发热，持续或间断发热3～21 d，体温在37.6 ℃～41 ℃，呈弛张热型或稽留热，一些患者伴有寒战、头痛、结膜充血、淋巴结肿大、皮疹、焦痂/溃疡等。有焦痂或溃疡的患者32例(94.12%)，其中焦痂或溃疡位于腹股沟10例(31.25%)，其次会阴的8例(25%)，腋窝的4例(12.50%)，胸部、脐周和下腹的各2例，颈部、背部、臀部和肛周的各1例。临床实验室检测白细胞计数升高占35.29%，淋巴细胞比例升高的占41.18%，嗜酸性粒细胞比例下降的占44.12%，谷草转氨酶升高的占44.12%(表2)。

表2永善县恙虫病患者主要临床特征
Tab.2Main clinical characteristics of scrub typhus patients in Yongshan County

临床表现病例数(%)临床实验室检测病例数(%)发热34(100)白细胞计数升高12(35．29)焦痂或溃疡32(94．12)中性粒细胞比例升高3(6．98)头痛24(70．59)淋巴细胞比例升高14(41．18)寒战23(67．65)嗜酸性粒细胞比例下降15(44．12)皮疹17(50)血小板计数减少7(20．59)淋巴结肿大8(23．53)谷丙转氨酶升高13(38．24)眼结膜充血7(20．59)谷草转氨酶升高15(44．12)

2.5巢式PCR检测及序列分析在农耕地放置鼠夹400个，一共捕获鼠类39只，均为黄胸鼠。对39份鼠脾做groEL基因检测，结果扩增到364 bp大小的groEL片断9份(阳性率23.08%)。

2.6基因groEL序列分析应用MegAlign软件将测序获得的样本groEL基因片段序列(361 bp)与GenBank中已知参考菌株相应序列进行同源性比较，结果序列YSP20、YSP22、YSP23、YSP26、YSP28、YSP33、YSP34、YSP35之间的同源性均为100%，YSP30与YSP20的同源性为99.4%。YSP20与Zhou/2012、UT213、SH205、Jin/2012的同源性均为100%，与Karp(M31887)和Kato(JX188393)的同源性均为99.7%，与 Kato(AY191586) 的同源性为99.4%，与 Gilliam的同源性为94.7%。YSP30与HSB1、FAR1、2049、UAP4、UAP1的同源性100%，与Karp的同源性为99.7%，与 Kato(JX188393)和Kato(AY191586) 的同源性分别为99.2%和98.9%，与 Gilliam的同源性为94.2%。

2.7系统进化树分析根据groEL基因片段序列(361 bp)进行系统进化树分析，结果YSP30序列与日本HSB1、FAR1、UAP4、UAP1株和泰国2049株在同一分支上，表明本次检测到的YSP30株与泰国2049、日本HSB1等恙虫病东方体菌株的遗传进化关系最密切；而YSP20等8株与泰国UT213和UT221、日本SH205、中国浙江Zhou/2012和Jin/2012株在同一个分支上，表明YSP20等8株与泰国UT213、日本SH205、中国浙江Zhou/2012和Jin/2012株的遗传进化关系最密切(图1)。

图1　根据恙虫病东方体groEL基因片段序列构建的系统发育进化树Fig.1　The phylogenetic tree constructed with partial groEL sequences from O.tsutsugamushi strains

3　讨　论

云南素有“动植物王国” 之称，宿主动物及媒介十分丰富，是恙虫病、斑疹伤寒、斑点热等多种立克次体疾病的高发地区[13-15]。近年来，该省恙虫病和斑疹伤寒局部暴发较为频繁[16]。永善县为云南东北部，地处乌蒙山脉西北面的金沙江南岸，海拔高低悬殊(340～3 199.5 m)，气候垂直变化显著，年均气温16.4 ℃，年均降水量666 mm，属中亚热带湿润气候区，适宜恙虫病主要宿主动物黄胸鼠和媒介恙螨的生存,黄胸鼠和恙螨较多[8]。永善县1973年曾证实存在恙虫病的流行[9]。2015年5-10月对永善县恙虫病疑似病例34例进行确认，其中实验室确诊病例21例、临床诊断病例13例。对该恙虫病病例做流行病学分析，发现其多发生在夏季7月和8月，发病年龄以30～49岁青壮年农民多见，与以往报告的云南省恙虫病流行情况基本一致[17]。本次研究的恙虫病患者中，焦痂或溃疡的发生率为94.12%，高于泰国[18]、山东[19]、安徽[20]等的73.1%～88.5%；皮疹的发生率为50%，高于泰国的32.1%[18]，与安徽的52.9%[20]相近。本次患者的焦痂或溃疡多位于腹股沟、其次位于会阴。临床实验室检测，本次患者的谷草转氨酶升高占44.12%，远低于安徽调查的81%[20]；另外，41.18%患者的嗜酸性粒细胞比例下降。

利用分子生物学方法对发病地区捕获的鼠的脾脏样本做恙虫病东方体groEL基因检测，阳性率为23.08%。对扩增到的9株恙虫病东方体groEL基因片段做序列分析，发现YSP20等8株与泰国UT213和UT221、日本SH205、中国浙江Zhou/2012和Jin/2012株遗传进化关系最密切(同源性均为100%)，而与Karp(M31887)和Kato(JX188393)遗传进化关系稍远(同源性均为99.7%)。文献报告泰国UT213、UT221株和日本SH205株为Karp型[4,21-22]，因此推断本次检测到的8株恙虫病东方体也可能属Karp型。本次检测到的另一株(YSP30)与日本HSB1、FAR1、UAP4、UAP1株的遗传进化关系最密切(同源性均为100%)，文献报告这些日本株为Saitama型[4,22-23]，因此YSP30也可能属Saitama型。本次研究首次报告永善县可能存在Karp型和Saitama型恙虫病东方体。groEL为编码恙虫病东方体58 kD蛋白抗原的保守基因，其常作为恙虫病东方体检测的靶基因，而较少用于菌株的基因分型，因此本次检测到9株恙虫病东方体的基因型别尚有待于进一步确认。

该次调查地为山区，村落较为分散，居住区被花椒地、水果地等农耕地包围，在这些发病地区采用鼠夹诱捕法对恙虫病宿主动物鼠类进行调查，所捕鼠类均为黄胸鼠，以往在云南北部金沙江流域和云南部分地区调查也发现黄胸鼠为优势鼠种[8，24]。本次调查的恙虫病患者居住的院落周围均有杂草，82.36%以上的患者家中可见鼠类活动，其有利于恙虫病的传播。目前，当地恙虫病的特异性诊断手段缺乏，恙虫病的诊断多依赖临床医生的经验，因此漏诊、误诊较多。本次发现恙虫病患者身体焦痂或溃疡的比例较高，应引起临床医生的高度重视，注意对发热患者的身体检查。本次通过血清学和分子生物学方法证实了永善地区存在恙虫病疫源地，应对该地区进行恙虫病的实时监测和防制。

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