泽泻对脾虚大鼠骨骼肌线粒体结构的影响

张亚敏 林文津 徐小妹 徐榕青 刘鹏 孙凤灵

【摘要】 目的：观察泽泻对脾虚大鼠骨骼肌线粒体结构的影响。方法：采用小承气汤建立脾虚大鼠模型，采用高、中、低三个不同剂量泽泻提取物（6.0、3.0、1.5 g/kg）对脾虚大鼠进行干预，阳性对照组灌饲四君子汤（10.5 g/kg），空白对照组灌饲等体积生理盐水，每日1次连续灌饲2周后，迅速取骨骼肌，分别制作骨骼肌光镜与电镜切片，光镜观察骨骼肌组织、电镜检测骨骼肌线粒体超微结构。结果：脾虚模型组大鼠骨骼肌细胞膜破裂变性，细胞边界模糊，肌间间隔无法分辨，线粒体外膜溶解，内嵴消失，周围的糖原颗粒明显减少；不同剂量泽泻干预组大鼠骨骼肌细胞边界有所恢复，肌间间隔也可以不同程度地分辨出来，线粒体外膜完整，内嵴较为清晰，同时周围有明显的糖原颗粒，不同剂量泽泻组对骨骼肌显微结构及线粒体结构均有改善作用，且改善程度随泽泻剂量的提高而增强，呈剂量依赖性。结论：泽泻对脾虚大鼠骨骼肌组织及线粒体结构具有改善作用，为进一步研究泽泻养五脏、益气力的作用机制奠定了科学基础。

【关键词】 泽泻； 脾虚； 骨骼肌； 线粒体； 超微结构

【Abstract】 Objective：To observe the effect of Rhizoma Alismatis Extract（RAE）on skeletal muscle mitochondrial structure of rats with spleen asthenia in vivo.Method：The rat model of spleen asthenia used Xiao Chengqi Decoction.Rhizoma Alismatis high，medium and low dose groups treated with RAE（6.0，3.0，

1.5 g/kg），the positive group treated with Sijunzi Decoction（10.5 g/kg），the normal control group dealt with same volume of saline，administration once daily，after two weeks，skeletal muscle were separated，slices of two tissue were prepared，skeletal muscle and mitochondrial ultrastructure were detected by light microscopy and electron microscopy.Result：In the spleen asthenia group，skeletal muscle membranolysis，cell boundary were obscure，interval were unable to distinguish，mitochondrial outer membrane dissolved，mitochondrial crista disappeared，the number of glycogenosome decreased.In the different doses RAE treated group，skeletal muscle cell boundary recovered，interval were able to distinguish，mitochondrial outer membrane were unbroken，crista were distinct，glycogenosome increased.Compared with the spleen asthenia group，RAE would improve the spleen asthenia rats mitochondrial structure and function，appeare dose-dependent manner tendency.Conclusion：RAE could improve skeletal muscle，mitochondrial ultrastructure of rats with spleen asthenia，which provide a theoretical foundation and scientific basis for further study the effect of “nourish the five internal organs and benefit the Qili” of Rhizoma Alismatis Extract.

【Key words】 Rhizoma Alismatis Extract； Spleen Asthenia； Skeletal muscle； Mitochondrial； Ultrastructure

First-authors address：Fujian Academy of Medical Sciences，Fujian Key Laboratory of Medical Measurement，Fuzhou 350001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.05.001

澤泻为泽泻科植物泽泻Alisma orientalis（Sam.） Juzep.的干燥块茎，性寒，味甘、淡，归肾、膀胱经，具有利水渗湿、泄热、化浊降脂的功效[1]。始载于《神农本草经》，列为上品，具有养五脏、益气力、肥健之功效[2-3]。现代研究发现，中药泽泻具有利尿[4]、降血脂[5-7]、降血糖[8]、抗感染[9-10]、保肝[9，11-14]、抗动脉粥样硬化[15]、防治骨质疏松[16-17]等作用。线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的主要场所，有细胞“动力工厂”之称。细胞损伤的自我修复、凋亡，糖脂代谢、肿瘤的发生以及衰老等多种病理生理过程都伴随着线粒体的能量代谢[18]。文献[19-21]从线粒体能量代谢角度探讨脾虚及健脾药效，前文笔者报道了不同泽泻提取物及23-乙酰泽泻醇B对细胞线粒体能量代谢的影响[22-23]，并发现了泽泻汤对高脂血症大鼠肝脏线粒体能量代谢影响的相关蛋白[24]。本文通过观察泽泻对脾虚大鼠骨骼肌及其线粒体结构功能影响，为研究泽泻养五脏，益气力的作用机制提供理论基础和科学依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 泽泻药材（批号：20150523）采集自福建省南平市建瓯吉阳镇，经福建省建瓯市吉阳镇农技站站长葛培盛鉴定为泽泻科植物泽泻Alisma orientalis（Sam.）Juzep.的干燥块茎。甲醛、乙醇、苏木精染液、盐酸、伊红、二甲苯、中性树胶、硬脂酸、石蜡等为国产分析纯。

1.2 仪器 Synergy2多功能酶标仪（BIO-TEK公司）、脱水机（湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司）、YB-6LF型生物组织石蜡包埋机（湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司）、BA-400型荧光双目光学显微镜（加拿大Motic公司）；石蜡切片机、半薄切片机、光学显微镜、超薄切片机（德国徕卡仪器有限公司）、透射电镜（日本日立电镜有限公司）。

1.3 实验动物 SPF级SD大鼠，由上海斯莱克公司提供，雌雄各半，平均体重（200±20）g，光/暗周期为12/12 h，光照时间7：00～19：00，温度为（23.0±0.5）℃。空气流通，相对湿度在40%～50%间，大鼠可自由获得饲料和饮水，适应性喂养一周后开始进行造模实验。本院实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2016-0004。

1.4 分组与给药 SD大鼠60只，随机分为六组（空白对照组、脾虚模型组、阳性对照组、泽泻高劑量组、泽泻中剂量组、泽泻低剂量组），每组10只，雌雄各半。除空白对照组外，其余五组每日灌饲小承气汤煎剂（大黄∶厚朴∶枳实=4∶5∶3），灌饲剂量为10 mL/kg，浓度为6 g生药/mL，空白对照组灌饲等体积生理盐水，隔日半量进食，自由饮水。连续灌饲4周后，阳性对照组灌饲四君子汤（灌饲剂量10.5 g/kg），泽泻高、中、低剂量组分别灌饲泽泻提取物（灌饲剂量6.0、3.0、1.5 g/kg），空白对照组及脾虚模型组给等体积生理盐水。每日1次连续灌饲2周后，采用水合氯醛麻醉，迅速对大鼠骨骼肌进行取材。

1.5 肝脏组织形态学检测 经取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色后观察不同组大鼠骨骼肌切片显微结构。

1.6 肝脏组织超微结构观察 经取材、前固定、漂洗、后固定、漂洗、脱水、浸透、包埋、聚合、切片、染色后观察骨骼肌线粒体超微结构。

2 结果

2.1 大鼠骨骼肌切片显微结构光镜观察结果 空白对照组骨骼肌肌细胞无明显肿胀，细胞膜光滑完整，肌间间隔均匀且细胞边界清晰可见，肌间隔有少量红细胞，细胞核的含量较多；脾虚模型组大鼠的细胞膜已经破裂变性，大部分细胞膜已经溶解，细胞边界非常模糊，肌间间隔分辨不出来；泽泻低剂量组大鼠骨骼肌部分细胞可以看到细胞边界，细胞膜也较为完整；泽泻中剂量组大鼠骨骼肌的边界大部分已经可以清晰地分辨出来，细胞膜也很完整；泽泻高剂量组大鼠骨骼肌细胞间的边界明显，细胞膜完整，同时有的肌间间隔很容易分辨，但是仍然有一部分细胞的肌间间隔不易分辨；阳性给药组的大鼠骨骼肌细胞无明显肿胀，细胞膜光滑完整，所有细胞肌间间隔均匀且细胞边界清晰可见，细胞核的含量较多。各组大鼠骨骼肌切片显微结构，见图1。

2.2 大鼠骨骼肌线粒体电镜观察结果 空白对照组骨骼肌在40 000倍透射电镜下可以清晰地看到平行肌丝构成的肌原纤维，肌丝的粗细非常清晰，并有明暗相间的横纹，同时还可以看到，在明带中央由电子密度较深的Z线，在暗带中部有较明的H带。肌原纤维之间椭圆形封闭的囊状结构为线粒体，线粒体外膜结构完整，有内外两层，内层结构折叠形成嵴，线粒体排列较为整齐，同时还可以看到线粒体周边存在大量的糖原颗粒。脾虚模型组骨骼肌在透射电镜下虽然也可以看到平行肌丝构成的肌原纤维，且粗丝、细丝结构较为清晰，但是大多数的线粒体结构已经发生明显变化，有的线粒体外膜已经溶解，有的线粒体内部的嵴已经消失形成空泡，甚至发生肿胀，线粒体周围的糖原颗粒也明显减少；泽泻低剂量组内一部分线粒体结构明显发生变化，内嵴消失空泡，甚至发生肿胀，但是依旧可以看到一部分细胞膜比较完整，能呈现出较为完整的线粒体结构；泽泻中剂量组可以明显看到一些完整的线粒体结构，外膜完整，未发生溶解，但是线粒体大小悬殊，一些线粒体外膜发生溶解，且糖原颗粒较少；高剂量组可见一些非常完整的线粒体，线粒体外膜结构完整，内层结构折叠形成嵴也较为清晰，同时周围有明显的糖原颗粒；阳性给药组线粒体外膜结构完整，嵴清晰，周围有较多明显的糖原颗粒。各组大鼠骨骼肌切片电镜照片，见图2。

3 讨论

目前脾虚动物模型的研究较为全面，主要包括苦寒泻下法、破气耗气法、饮食伤脾法、偏食五味法、劳倦伤脾法、理化因素损伤法、复合因素造模法等[25]。本研究采用的破气耗气法是依据脾虚忌下，长期或过用广豆根、槟榔、厚朴、枳实、厚朴等破气降气中药，逆脾气主升之性从而造成脾气虚证。破气耗气法是由苦寒泻下法演变而成，主要是为了延长造模时间，避免伤阴、伤阳和导致中气下陷。本实验发现，建立的脾虚模型大鼠体重增速明显降低，活动程度明显下降，毛色差，粪便稀，符合中医脾气虚证相关指标。

骨骼肌作为大鼠的主要运动组织，需要消耗大量的能量进行伸缩活动，内含较多的线粒体，当外部环境发生变化导致线粒体能量代谢发生障碍的时候，会影响骨骼肌线粒体的功能，在线粒体的结构上亦可表现出来。光镜与透射电镜观察结果表明，泽泻各给药组能改善脾虚大鼠骨骼肌及其线粒体超微结构，而且泽泻的作用随着给药剂量的增加而加强，呈现出剂量依赖性，另外实验过程中笔者还初步检测了线粒体膜电位、ATP含量、琥珀酸脱氢酶（SDH）、活性氧簇（ROS）活性等指标，初步结果也支持这一结论，与文献[22-23]报道的研究结果一致。

试验设计过程中，笔者还选择了胃黏膜组织进行线粒体结构和功能的检测，但试验结果发现，胃黏膜上线粒体较少，线粒体功能指标组内差异较大，有可能是胃黏膜取样时，取样难度较大，花费的时间较长，此时线粒体已损伤，再检测膜电位等指标时，已不能反映体内的实际情况，误差较大，不适合作为脾虚治疗效果好坏的评价标准，骨骼肌相对来说线粒体含量较高，所以受实验操作的影响较小，可以部分线粒体活性指标反映出线粒体能量代谢的情况。

清代醫学家陈修园在《神农本草经读》中提到：“五脏主藏阴，而脾为五脏之原，一得水精之气则能灌溉四旁，俾五脏循环而受益，不特肥健消水不饥，见本藏之功”。因此，笔者推测陈修园所谓泽泻的“养五脏、益气力”功效，其机制可能与泽泻能够改善骨骼肌线粒体能量代谢有关，其具体分子机制还有待于下一步研究。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2015：229.

[2] Zhang L L，Xu W，Xu Y L，et al.Therapeutic potential of Rhizoma Alismatis：a review on ethnomedicinal application，phytochemistry，pharmacology，and toxicology[J].Ann N Y Acad Sci，2017，1401（1）：90-101.

[3] Shu Z，Pu J，Chen L，et al.Alisma orientale：Ethnopharmacology，Phytochemistry and Pharmacology of an Important Traditional Chinese Medicine[J].Am J Chin Med，2016，44（2）：227-251.

[4] Zhang X，Li X Y，Lin N，et al.Diuretic Activity of Compatible Triterpene Components of Alismatis rhizoma[J].Molecules，2017，22（9）：E1459.

[5] Miao H，Zhang L，Chen D Q，et al.Urinary biomarker and treatment mechanism of Rhizoma Alismatis on hyperlipidemia[J].Biomed Chromatogr，2017，31（4）：e3829.

[6] Li S，Jin S，Song C，et al.The metabolic change of serum lysophosphatidylcholines involved in the lipid lowering effect of triterpenes from Alismatis rhizoma on high-fat diet induced hyperlipidemia mice[J].J Ethnopharmacol，2016，177：10-18.

[7] Jeong H S，Cho Y H，Kim K H，et al.Anti-lipoapoptotic effects of Alisma orientalis extract on non-esterified fatty acid-induced HepG2 cells[J].BMC Complement Altern Med，2016，16：239.

[8] Ding C Y，Tan Q Y，Shi N C.Alisma versus Gliclazide in the Treatment of Primary Diabetes in Goto-Kakizaki Rats[J].Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao，2015，37（4）：451-455.

[9] Bi X，Wang P，Ma Q，et al.Anti-Inflammatory Activities and Liver Protection of Alisol F and 25-Anhydroalisol F through the Inhibition of MAPK， STAT3，and NF-kappaB Activation In Vitro and In Vivo[J].Molecules，2017，22（6）：E951.

[10] Kim K H，Song H H，Ahn K S，et al.Ethanol extract of the tuber of Alisma orientale reduces the pathologic features in a chronic obstructive pulmonary disease mouse model[J].J Ethnopharmacol，2016，188：21-30.

[11] Liu J，Zhuang Z J，Tian J，et al.Effect of Compound Zhajin Granule on Toll-like Receptor 4 Signaling Pathway in Nonalcoholic Steatohepatitis Mice[J].Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2016，36（4）：460-465.

[12] Kim Y，Lee I S，Kim K H，et al.Metabolic Profiling of Liver Tissue in Diabetic Mice Treated with Artemisia Capillaris and Alisma Rhizome Using LC-MS and CE-MS[J].Am J Chin Med，2016，44（8）：1639-1661.

[13] Meng Q，Chen X，Wang C，et al.Protective effects of alisol B 23-acetate from edible botanical Rhizoma alismatis against carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in mice[J].Food Funct，2015，6（4）：1241-1250.

[14] Jang M K，Han Y R，Nam J S，et al.Protective Effects of Alisma orientale Extract against Hepatic Steatosis via Inhibition of Endoplasmic Reticulum Stress[J].Int J Mol Sci，2015，16（11）：26151-26165.

[15] Xue X H，Zhou X M，Wei W，et al.Alisol A 24-Acetate，a Triterpenoid Derived from Alisma orientale，Inhibits Ox-LDL-Induced Phenotypic Transformation and Migration of Rat Vascular Smooth Muscle Cells through Suppressing ERK1/2 Signaling[J].Journal of Vascular Research，2016，53（5-6）：291-300.

[16] Hwang Y H，Kang K Y，Lee S J，et al.The Protective Effects of Alisol A 24-Acetate from Alisma canaliculatum on Ovariectomy Induced Bone Loss in Vivo[J].Molecules，2016，21（1）：74.

[17] Kim K J，Leutou A S，Yeon J T，et al.The Inhibitory Effect of Alisol A 24-Acetate from Alisma canaliculatum on Osteoclastogenesis[J].International Journal of Endocrinology，2015，2015：132436.

[18] Zhang A，Sheng Y，Zou M.Antiproliferative activity of Alisol B in MDA-MB-231 cells is mediated by apoptosis，dysregulation of mitochondrial functions，cell cycle arrest and generation of reactive oxygen species[J].Biomedicine & Pharmacotherapy，2017，87：110-117.

[19]吕林，王凤云，唐旭东，等.脾虚一号方对脾虚型功能性消化不良大鼠胃组织线粒体呼吸链复合物Ⅳ亚单位的影响[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（7）：102-108.

[20]戎志斌，罗安明，姚乃礼.“脾虚-线粒体-有氧糖酵解-肿瘤关联”病因病机新假说[J].医学争鸣，2016，7（1）：19-22.

[21]胡芳玉，宋雅芳，雷孝文.从线粒体生物合成及其调控信号通路探讨脾虚与重症肌无力的相关性[J].辽宁中医杂志，2016，43（7）：1379-1381.

[22]林文津，徐榕青，张亚敏，等.23-乙酰泽泻醇B对SGC-7901细胞线粒体能量代谢的影响[J].中药新药与临床药理，2015，26（1）：30-34.

[23]林文津，徐榕青，張亚敏，等.泽泻不同提取物对SGC-7901细胞线粒体能量代谢的影响[J].中药新药与临床药理，2014，25（1）：36-39.

[24]徐小妹，林文津，张亚敏，等.泽泻汤对高脂血症大鼠肝脏线粒体蛋白质组的影响[J].福建医药杂志，2016，28（3）：53-57.

[25]吴天石，张会永，张哲，等.脾虚证动物模型造模方法述评[J].中医杂志，2015，56（11）：978-983.