不同来源精子应用于ICSI治疗的早期临床结局

汤友苗 王兴玲 娄华 乔玉莲 杜明泽

【摘要】 目的：比较不同来源精子应用于卵胞浆内单精子显微注射（ICSI）治疗的胚胎发育及早期临床结局。方法：回顾性分析2014年1月-2016年6月因男性因素在郑州大学第三附属医院生殖中心行ICSI治疗的1 732个新鲜移植周期。根据精子来源分为：A组射精组（n=1 253），B组经皮附睾精子抽吸（PESA）组（n=418），C组经皮睾丸精子取精（TESA）组（n=61）。比较三组正常受精率、正常卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率、异位妊娠率、流产率、活产率及早产率。结果：C组的正常受精率、正常卵裂率均低于A组和B组（P<0.05），B组优质胚胎率高于A组和C组（P<0.05），B组临床妊娠率高于A组（P<0.05），三组异位妊娠率、流产率、活产率及早产率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：PESA和TESA均可以用于梗阻性无精子症患者的助孕，但就早期胚胎质量和临床妊娠率综合考虑，经皮附睾取精行卵胞浆内单精子显微注射术更优。

【关键词】 卵胞浆内单精子显微注射； 精子来源； 經皮附睾精子抽吸术； 经皮睾丸精子取精术；妊娠结局

【Abstract】 Objective：To compare the embryonic development and early clinical outcomes of intracytoplasmic sperm injection（ICSI） with sperm from different sources.Method：The date of 1 732 cases received ICSI from January 2014 to June 2016 in Reproductive Medicine Center of the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University was analyzed retrospectively.According to the source of sperm，all cases were divided into group A（ejaculation group，n=1 253），group B[percutaneous epididymal sperm aspiration（PESA），n=418]，group C[testicular sperm extraction（TESA），n=61].The embryonic development and pregnancy outcomes among three groups were compared.Result：The rate of normal fertilization and cleavage in group C were significantly lower than those in group A and group B（P<0.05）.Group B had more good-quality embryo than those of group A and group C（P<0.05）.The clinical pregnancy rate in group B was higher than that in group A（P<0.05）.There were no significant differences in ectopic pregnancy rate，abortion rate，live birth rate and premature delivery rate among three groups（P>0.05）.Conclusion：PESA and TESA can be used in patients with obstructive azoospermia.However，considering the early embryonic quality and clinical pregnancy rate，PESA-ICSI is better.

【Key words】 Intracytoplasmic sperm injection； Sperm source； Percutaneous epididymal sperm aspiration； Testicular sperm extraction； Pregnancy outcome

First-authors address：The Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.05.006

近年来，不孕不育发病率大幅上升，有资料显示全球不孕不育夫妇比例占15%，其中男性因素约占50%[1]。自Palermo等[2]首次用卵胞浆内单精子显微注射术（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）使体外受精（in-vitro fertilisation，IVF）或者透明带下人工授精（subzonal insemination，SUZI）不能妊娠的女性成功生育后，该技术便受到国内外学者的关注和研究。ICSI技术是借助显微操作系统将单个精子直接注射入卵母细胞质内使其受精，它对精子数量和质量的要求大大降低，这对重度少弱精以及因梗阻性无精子症需要睾丸或者附睾取精的男性不育症患者具有重大意义。目前应用于ICSI治疗的精子来源主要有三种：一种是射出精子，另外两种是经皮附睾精子抽吸术（percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA）和经皮睾丸精子取精术（testicular sperm extraction，TESA）获得的精子[3]。不同来源的精子在结构、成熟度、活动力等方面均存在差异，而这种差异是否会影响早期胚胎质量和妊娠结局，国内外文献结果不一，值得进一步研究。本研究回顾性分析因男性因素在郑州大学第三附属医院进行ICSI治疗的临床病例，旨在比较不同精子来源应用于ICSI治疗的胚胎发育情况及早期临床结局，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2014年1月-2016年6月因男性因素在郑大三附院行ICSI治疗的1 732个新鲜移植周期。根据精子来源分为射精组（A组）、PESA组（B组）及TESA组（C组）。男方为单纯性的重度少弱精子症（精子浓度<5×106/mL和/或b+c级<30%，a级为0）患者入选为A组，共1 253个周期；男方为梗阻性无精子症（至少三次精液常规检查并离心沉淀镜检未发现精子，睾丸或附睾穿刺证实有精子）患者入选为B组，共418个周期；经PESA未获得精子的梗阻性无精子症患者入选为C组，共61个周期。纳入标准：（1）男女双方染色体均正常；（2）女方年龄<40岁；（3）不孕年限≤15年；（4）女方基础卵泡刺激素（FSH）<10 mIU/mL；（5）女方体重指数（body mass index，BMI）介于18～25 kg/m2。排除标准：（1）女方患子宫内膜异位、子宫畸形、子宫多发性息肉及全身性疾病（如高血压、糖尿病）；（2）获卵总数<3个；（3）免疫性不孕；（4）数据资料不完整者。该研究已经伦理学委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 控制性超促排卵与取卵 根据患者个人情况采用本中心常规长方案/短方案/微刺激方案进行促排卵，当有2个以上优势卵泡直径≥18～20 mm时，皮下注射重组人绒促性素注射液250 μg，36～40 h后在阴道超声引导下行阴道后穹隆穿刺取卵术，取卵2 h后用透明质酸酶进行脱颗粒处理，然后置于G1培养液中备用，选取成熟卵子（MⅡ期）待行ICSI注射。

1.2.2 精子获取与处理 A组患者取精前禁欲3～7 d，取卵当天采用手淫方式留取精液标本，然后采用Puresperm密度梯度离心法处理精液，选择活动精子行ICSI。B组患者取仰卧位，常规消毒铺巾后选择穿刺点，将2%利多卡因注射在阴囊部精索内，阻滞麻醉精索神经。注射器连接头皮静脉针，术者左手将附睾固定于阴囊皮下，将针头直接经皮刺入附睾头，助手持注射器抽吸附睾液，抽出淡黄色浑浊附睾液，于倒置显微镜下观察有无活动精子，如果有则采用密度梯度离心法处理标本，如果无则行对侧附睾抽吸。结束后稍压迫穿刺点至无出血，无菌敷料覆盖。C组患者体位、消毒、麻醉同B组，术者左手固定睾丸，选择无血管区域，持注射器直接经皮刺入睾丸（有落空感）进行睾丸穿刺，将取得的标本放于倒置显微镜下观察有无活动精子，若有吹打混匀后采用直接离心法处理标本。结束后稍压迫穿刺点至无出血，无菌敷料覆盖。

1.2.3 受精、胚胎发育及妊娠评估 ICSI 16～18 h后观察卵母细胞的受精情况，观察到雌雄两原核（2PN，pronucleus）者为正常受精，第2、3天观察胚胎卵裂情况，根据卵裂球的数目、均一性、胞浆及碎片比例进行评分，第3天根据患者情况和胚胎质量进行移植，移植后给予常规黄体支持。移植后14 d进行尿hCG和血β-hCG检测，移植后35 d进行超声检查可见妊娠囊及原始心管搏动定义为临床妊娠，受精卵在子宫腔外着床定义为异位妊娠，妊娠不足28周、胎儿体重不足1 000 g而终止者定义为流产，妊娠满28周至不足37周（196～258 d）间分娩者定义为早产。

1.3 观察指标 分析三组正常受精率、正常卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率、异位妊娠率、流产率、活产率、早产率。2PN受精率=2PN卵子数/ICSI患者的成熟卵子数×100%，2PN卵裂率=2PN卵裂数/2PN卵子数×100%，优质胚胎率=优质胚胎数/2PN卵裂数×100%，临床妊娠率=临床妊娠数/移植周期数×100%，异位妊娠率=异位妊娠数/临床妊娠数×100%，流产率=流产数/临床妊娠数×100%，活产率=有活产婴儿出生的分娩次数/移植周期数×100%，早产率=早产数/临床妊娠数×100%。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用单因素方差分析；计数资料以率（%）表示，比较采用行×列 字2检验。检验水准为α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组一般资料比较 三组女方年龄、男方年龄、女方BMI、不孕年限、基础FSH、基础雌二醇（E2）、基础促黄体生成素（LH）、移植日内膜厚度、获卵总数及成熟卵子数比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性，见表1。

2.2 三组胚胎发育情况比较 C组2PN受精率和2PN卵裂率均低于A组与B组，B组优质胚胎率高于A组和C组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.3 三组妊娠结局比较 B组临床妊娠率高于A组，差异有统计学意义（P<0.05）；三组异位妊娠率、流产率、活产率、早产率比较，差异均无统计学差异（P>0.05）。见表3。

3 讨论

近年来，由于受社会与生活环境、家庭与工作压力、不良生活习惯等诸多因素的综合影响，男性生育力呈现逐年下降的趋势，男性不育已成为严重影响社会安全、家庭质量的公共健康问题。重度少弱精及梗阻性无精子症是男性不育病因中的两种，对于梗阻性无精子症的治疗可以通過外科手术获得自然妊娠，也可以通过PESA或TESA结合ICSI获得自己的后代。本文主要探讨通过PESA、TESA取精结合ICSI和重度少弱精行ICSI所产生的早期胚胎发育及妊娠结局。

对于不同来源精子行ICSI的胚胎发育情况来说，文献[4-6]指出ICSI中使用不同来源精子可获得相似的受精率，卵裂率和优质胚胎率。本研究结果显示三组2PN受精率，2PN卵裂率及优质胚胎率比较，差异均有统计学意义（P<0.05），这与国内外一些学者的结果相似[7-10]。本研究中C组2PN受精率和卵裂率均显著低于A组与B组，B组优质胚胎率高于A组和C组，得出睾丸精子与射出精子和附睾精子行ICSI相比，受精能力降低，胚胎质量较差。正常情况下，精子在睾丸精曲小管形成后，生理上还不成熟，不能活动或活动能力很弱，无受精能力，只有经过附睾，在附睾内（14 d左右）从周围吸收各种物质，发生一系列形态、生理和生化方面的变化，从而完成成熟过程，具备受精能力；Huang等[11]研究指出睾丸精子与射出精子相比，成熟度降低，浓度和活力下降，畸形率升高，染色体异常的比例也增加，这些原因可能导致睾丸精子受精率低、胚胎质量下降。

对于不同来源精子行ICSI的早期临床妊娠结局来说，本研究结果显示PESA组临床妊娠率高于射精组，差异有统计学意义（P<0.05），这与于洪君等[9]结果相似，董瑞娜等[8]对3 106个不同来源精子ICSI周期进行分析，也得出PESA组临床妊娠率显著高于射出组。早前就有研究显示对于同一个体来说，射出精子可能缺少细胞的营养支持，加剧氧化应激对精子细胞成分的影响，导致它的DNA断裂相应增加，妊娠率明显降低[11]，国外文献[12-14]也报道精子在通过男性生殖道时可能会受到损伤，就DNA的完整性而言精子质量会降低。本研究中射精组为重度少弱精患者，此类患者受精过程多因基因、内分泌、免疫等因素而引起异常，从而导致精子数量、形态、活动能力和功能的异常；相比而言，PESA组患者不孕原因多为输精管梗阻，自身生精功能无明显异常，这方面也可能是导致PESA组患者妊娠率高于射出组的原因。本研究结果还显示，三组异位妊娠率、流产率、活产率及早产率比较，差异均无统计学意义（P>0.05），这与大多数学者研究结果一致[8-9，15-16]，认为妊娠后胎儿发育情况与精子的来源关系不大。

综上所述，重度少弱精及PESA、TESA取精结合ICSI均可以用于男性不育患者的助孕手段，就早期胚胎发育和临床妊娠率综合方面考虑，经皮附睾精子抽吸术行ICSI可能结果更令人满意。但ICSI技术人为地将精子注射入卵母细胞内，可能存在表观遗传学的改变，这就增加了子代安全性的风险。所以临床上行ICSI治疗的患者均应该进行染色体检查，遗传学评估，以提高子代安全性。此外由于本研究样本量小，局限于胚胎早期发育和临床妊娠方面，缺少对后期结局和子代安全性的观察，所以仍需要大样本、长期随访。

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