响应面法优化短短芽孢杆菌S1039发酵培养基的研究

王忠忠， 佐　静， 毛　雯， 龚国利,2

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安　710021； 2.西安市微生物药物工程实验室， 陕西 西安　710021)

0　引言

近二十年来，由于动物源性及食源性疾病的爆发，严重威胁着人类生命安全及健康，随之而来的是各类抗生素和化学试剂的过量使用及滥用，这不仅使大量的病原菌产生耐药性，而且污染环境.因此，寻找一种新的能够高效防治病原菌并且不产生耐药性的抗菌物质成为了许多科研工作者研究的重点.细菌素或类细菌素作为主要由乳酸杆菌和芽孢杆菌产生的抗菌化合物，它具有良好的热稳定性、耐酸碱、无耐药性并且作用范围广.例如，枯草芽孢杆菌产生的脂肽类抗生素: 伊枯草菌素(Iturin)、表面活性素(Surfactin)等对人体肠道中的致病性大肠杆菌(PathogenicEscherichiacoli)、产毒性大肠杆菌(EnterotoxigenicE.coli) 、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)有较强的抑制作用[1].地衣芽孢杆菌(Bacilluslichnifarimis)产生的杆菌肽能够有效抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、甲烷杆菌(Methanebacillus)等G+和G-细菌[2,3].多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)产生的碱性多肽类抗生素多粘菌素E对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)等革兰氏阴性杆菌有强烈的杀菌作用[4].

短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)是一种广泛分布于空气、土壤、海底淤泥等环境中的革兰氏阳性菌，其产生的抗菌物质有伊短菌素[5]、短杆菌肽[6-8]、短杆菌酪肽[9]、乐菌素[10]、几丁质酶[11]以及羟苯乙酯[12]等.Murray T等[13]探究发现的十肽细菌素，短杆菌肽S已被证明具有高效的杀菌能力.Sheng L I等[11]发现的短短芽孢杆菌no.G1产生的高稳定性的几丁质酶在蔬菜霉菌病的防治中已表现出显著的抗菌效果.Wafaa M等[14]报道的短短芽孢杆菌产生的抗菌活性物质能够成功抑制番茄和生菜体内外的灰霉病.Bapat S等[15]报道的抗菌物质有可能作为一种生防试剂治愈豌豆和黄瓜农作物的镰刀菌枯萎病.同时，短短芽孢杆菌产生的胞外拮抗物质能够诱导霉菌病原体的肿胀，导致其细胞破裂而死亡[16].并且该菌能以活体形式寄居到大量的真菌植物病原体中有效的抑制病原体的生长[17,18]，以上大量研究充分说明了短短芽孢杆菌产生的抗菌物质在农作物及植物病害防治上具有广阔的应用前景，而本研究鉴定的短短芽孢杆菌S1039[19]产生的分子量为19kD左右类细菌素(抗菌蛋白)对大多数的革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌都具有强的抗性，尤其对常见的造成严重感染的金黄色葡萄球菌病原菌抑制潜力巨大，而目前应用于此菌株发酵生产的培养基营养成分是在前人相关研究的基础上汇总而来，不一定适用于此菌株的发酵.因此通过单因素试验及响应面优化菌株S1039的发酵培养基对于提高类细菌素的抑菌活性就显得尤为重要，可为短短芽孢杆菌S1039类细菌素的进一步开发利用奠定理论基础.

1　材料与方法

1.1　菌株

供试菌株为短短芽孢杆菌BrevibacillusbrevisS1039，活性指示菌:金黄色葡萄球菌CICC21600均由本实验室提供.

1.2　培养基

(1)营养肉汤培养基(NA)：蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂1.5%，pH 7.2.

(2)初始发酵培养基： 糊精1.5%， 蛋白胨2.0%， CaCl20.20%，Tween-20 1%，pH 7.2.

1.3　仪器与设备

SW-CJ-1G型单人净化工作台,苏州净化设备有限公司；HWS 型恒温恒湿培养基箱,上海比朗仪器有限公司；TGL-16M型高速冷冻离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；TX B622L型电子天平,捷久计量衡器上海有限公司；PHS-25型pH计,上海科学精密仪器有限公司；YXQ-LS-50SⅡ型立式压力蒸汽灭菌锅,上海博迅实业有限公司.

1.4　发酵培养条件

从菌株S1039活化斜面上挑取2环接种到含50 mL NA培养基300 mL锥形瓶，37 ℃、220 r/min培养14 h，制得种子液.按6%的接种量接种到装有70 mL发酵培养基的300 mL锥形瓶，28 ℃、200 r/min培养48 h，11 000 r/min离心10 min，除菌体得含有抗菌活性物质的发酵上清液.4 ℃保存备用.

1.5　抑菌活性物质测定方法

采用双层平板琼脂扩散法进行菌株S1039发酵上清液抑菌活性测定.平板底层加入15 mL素琼脂水溶液，上层加入25 mL NA(混有金黄色葡萄球菌CICC1600)，制成指示细菌培养基.无菌牛津杯(6 mm)打孔，加入200μl 的抗菌上清液，测定其抑菌活性，抑菌活性的大小用抑菌圈直径来表示.

1.6　不同培养基成分对类细菌素生成的影响

1.6.1碳源及其添加量

在初始发酵培养基的基础上，分别加入1.5%的糊精、葡糖糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、马铃薯淀粉作为碳源，并以不加碳源的培养基作为对照(CK)，选出最佳碳源后对其添加量进行优化，添加量分别设为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%，采用琼脂打孔扩散法测定抑菌活性.

1.6.2氮源及其添加量

在初始发酵培养基的基础上，分别加入2%的牛肉膏、玉米浆、酵母膏、豆饼粉、蛋白胨、胰蛋白胨、硝酸钾作为氮源，并以不加氮源的培养基作为对照(CK)，选出最佳氮源后对其添加量进行优化，添加量分别设为1%、2%、3%、4%、5%、6%，采用琼脂打孔扩散法测定抑菌活性.

1.6.3无机盐及其添加量

在初始发酵培养基的基础上，分别加入0.20%的NaCl、MgSO4、KH2PO4、CaCl2、FeCl3作为菌株S1039生长代谢的无机盐成分，并以不加无机盐的培养基作为对照(CK)，选出最佳无机盐成分后对其添加量进行优化，添加量分别设为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%，采用琼脂打孔扩散法测定抑菌活性.

1.6.4代谢促进剂及其添加量

在初始发酵培养基的基础上，分别加入1%的Tween-20、 Tween-80作为菌株S1039生长代谢的生长因子，并以不加Tween的培养基作为对照(CK)，选出最佳Tween种类后对其添加量进行优化，添加量分别设为0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%、2.8%.采用琼脂打孔扩散法测定抑菌活性.

1.7　Box-Behnken实验设计和响应面分析

采用软件Design-Expert.V8.0.6中的Box-Behnken模块对发酵培养基中的四种营养因子进行实验设计安排，并对其试验结果进行响应面分析，用F检验评价模型方程的显著性，方程的拟合性由R2确定.

2　结果与讨论

2.1　上清液抑菌活性

采用双层平板琼脂扩散法测定抗菌上清液的抑菌活性，其结果如图1所示.由图1可以看出，以金黄色葡萄球菌CICC21600(106 CFU/mL)做指示菌，上清液的抑菌圈直径为16.2 mm，说明菌株S1039产生的抗菌物质具有良好的抑菌活性[20].

1：200 μl 发酵上清液；2：200 μl 空白发酵培养基图1　拮抗菌株S1039发酵上清液抑菌活性测定

2.2不同碳源及其添加量对类细菌素抑菌活性的影响

碳源是菌体生长最重要的营养因子，菌体的大部分固体成分来自培养基的碳源，抑菌物质的分子骨架也是来自培养基中的碳源.因此选择合适的碳源不仅对菌体的生长而且对抑菌物质的产生都极为重要.如图2所示是不同碳源及马铃薯淀粉添加量对类细菌素抑菌活性的影响.由图2(a)可知，马铃薯淀粉和乳糖对类细菌素抑菌活性影响最为明显，当马铃薯淀粉作为培养基碳源时，菌株S1039产生的抗菌物质的抑菌活性最高，其抑菌圈直径达21.3 mm.当乳糖作为培养基碳源时，菌株S1039产生的抗菌物质的抑菌活性最低，抑菌圈直径为12.15 mm.因此选择马铃薯淀粉作为培养基的碳源.由图2(b)可以进一步看出，最适马铃薯淀粉的添加量为1.5%，此时抗菌物质的抑菌活性最高.

(a)碳源对抑菌活性影响

(b)马铃薯淀粉对抑菌活性的影响图2　不同碳源及最适碳源添加量对菌株S1039抑菌活性的影响

2.3不同氮源及其添加量对类细菌素抑菌活性的影响

氮源及最适氮源添加量对菌株S1039产生的抗菌物质的抑菌活性影响如图3所示.由图3(a)可知，蛋白胨和KNO3对菌株S1039的抑菌活性影响最为明显，当蛋白胨作为培养基的氮源时，类细菌素的抑菌活性最高，其抑菌圈直径可达23.4 mm，当KNO3作为培养基的氮源时，类细菌素的抑菌活性几乎没有，造成这种结果可能的原因是菌体无法利用KNO3形成自身所需的氮源物质，从而使细胞生长受阻，影响代谢产物的分泌.因此选择蛋白胨作为发酵培养基的氮源，从图3(b)可以进一步看出，当最适氮源蛋白胨添加量为3%时，菌株S1039产生的类细菌素抑菌活性最高.

(a)氮源对抑菌活性的影响

(b)蛋白胨对抑菌活性影响图3　不同氮源及最适氮源添加量对菌株S1039抑菌活性的影响

2.4不同无机盐及其添加量对类细菌素抑菌活性的影响

无机盐及最适无机盐添加量对菌株S1039产生的抗菌物质的抑菌活性影响如图4所示.由图4(a)可知，当培养基的无机盐成分为CaCl2时，类细菌素的抑菌活性最高.而FeCl3作为培养基的无机盐时，菌株S1039无抗菌活性物质产生，表明该菌体无法吸收利用Fe3+，也可能是Fe3+对菌体细胞的生长及产物代谢具有毒理性作用.从图4(b)可以进一步看出，选择最适无机盐CaCl2的添加量为0.15%，菌株S1039产生的抗菌物质的抑菌活性最高，抑菌圈直径达27.8 mm.

(a)无机盐对抑菌活性的影响

(b)CaCl2对抑菌活性的影响图4　不同无机盐及最适无机盐添加量对菌株S1039抑菌活性的影响

2.5表面活性剂及其添加量对类细菌素抑菌活性的影响

在培养基中加入Tween-20、Tween-80等表面活性物质，探究其对菌株S1039产生的类细菌素抑菌活性影响，结果如图5所示.由图5(a)可知，Tween-20、Tween-80均对该菌产生的抗菌物质的抑菌活性有不同程度的促进作用.由图5(b)可以进一步看出，当Tween-20的添加量为1.2%时，类细菌素的抑菌活性最高.这可能是Tween作为一种乳化剂，能够为菌株的生长提供脂肪酸，也可能作为一种类似维生素的物质，有助于抗菌物质的产生[21].除此之外，Tween可降低菌体与培养基接触面之间的表面张力，从而改善微生物细胞膜的通透性，促进营养物质进入细胞及代谢产物排出体外，因而可促进抗菌物质的产生和活力的增强.

(a)Tween对抑菌活性的影响

2.6　Box-Behnken实验结果分析

Box-Behnken实验因素水平设计及结果见表1、表2所示.以菌株S1039的抑菌圈直径为响应值(Y),利用Design-Exper t.V8.0.6软件对Box-Behnken的实验结果进行回归拟合及回归分析，得到响应值Y与因子X之间的回归方程Y=25.24+0.91X1+1.17X2-8.333E-003X3+0.14X4-0.70X1X2+0.15X2+1.52X2X4-0.60X3X4-2.79X12-1.47X22-2.67X32-2.39X42.回归方程的方差分析见表3所示.由表3中的回归分析结果可知，回归模型方程中的常量项p值小于0.000 1，(p<0.05)，失拟项p值为0.157 9(p>0.05)表明该回归方程模型的显著性及可靠性很好,其中X1，X2，X1X2，X1X4，X2X4，X3X4，X12，X22，X32，X42对菌株M01的抑菌活性都有显著的影响(p<0.05)，决定系数R2为0.993 4，表明此回归方程拟合得很好，具有高度的相关性，此模型可用于抗菌物质抑菌活性的分析和预测.

表1　Box-Behnken实验的因素与水平设计

表2　Box-Behnken实验设计和结果

表3　回归模型的方差析

*表示不显著P>0.05；** 表示不显著P>0.05；***表示非常显著P<0.01.

2.7　响应面分析

根据响应面试验结果绘制的3D响应面图及等高线图，是对回归模型的一种图形表达，通过这些图形可以进一步分析培养基各因子及各因子之间对菌株S1039抑菌活性的影响.观察所拟合的响应面的形状，每个3D响应面图都分别代表着两因素之间的交互作用，此时另外两个因素水平保持不变.如图 6～11所示是试验四因素两两之间的交互作用对Y值(抑菌圈直径)影响的直观表示.

由图6的3D响应面图可以看出，存在极大值点X1和X2使得Y值最大；同时，从图7～11的3D响应面图也都能够看出，各因子之间的交互作用存在极大值点使得响应值Y最大.除此之外，可以从图 5～10的等高线图中直观的看到两因素的交互作用对Y值的影响是否显著，图6、8、10、11等高线图轮廓为椭圆状，这表明X1与X2、X4；X4与X2、X3之间的交互作用对Y值的影响显著；图7、9等高线轮廓近似圆形，表明X3与X1、X2之间的交互作用对Y值的影响不显著.根据上述图形的变化趋势分析，得到四个因子的最佳试验点为X1：12.8 g/L，X2：27.4 g/L，X3：1.2 g/L，X4：1.05%，此时预测抑菌圈直径为25.58 mm.

图6　X1与X2对Y值预测的响应面图和等高线图

图7　X1与X3对Y值预测的响应面图和等高线图

图8　X1与X4对Y值预测的响应面图和等高线图

图9　X2与X3对Y值预测的响应面图和等高线图

图10　X2与X4对Y值预测的响应面图和等高线图

图11　X3与X4对Y值预测的响应面图和等高线图

2.8　验证试验

为了验证模型预测结果，在优化条件下X1：12.8 g/L，X2：27.4 g/L，X3：1.2 g/L，X4：1.05% 处进行3组装液量70 mL(300 mL锥形瓶)的发酵试验，琼脂打孔扩散法测定抗菌物质的平均抑菌圈直径为25.4mm.这与抗菌物质抑菌直径最大预测值25.58 mm非常接近，表明实验值与预测值之间有良好的拟合性，进而证实了回归模型的有效性.

3　结论

短短芽孢杆菌是一种能够产生多种抗菌物质的芽孢杆菌，其产生的抗菌物质根据是否由核糖体产生分为细菌素(核糖体)或类细菌素(非核糖体).本课题组分离保存的短短芽孢杆菌S1039产生的抗菌物质是非核糖体细菌素，对大多数的革兰氏阴性菌及阳性菌具有明显的抗性，尤其对金黄色葡萄球菌，宋氏志贺氏菌等病原菌抗性更强.因此设法提高该抗菌化合物的活性就显得尤为重要.本研究通过单因素试验及响应面法优化了菌株S1039发酵培养基，优化后的培养基成分为马铃薯淀粉12.9 g/L、蛋白胨 27.6 g/L、CaCl21.2 g/L、Tween-20 1.05%.此时细菌素的抑菌直径为25.4 mm，比初始发酵培养基发酵生产的抗菌物质抑菌活性提高了56.8%，结果表明，通过响应面法对短短芽孢杆菌S1039发酵培养基进行优化，能够明显提升发酵液中类细菌素的抑菌性能，这对后续该菌种工业规模化生产抗菌代谢物具有重要的理论参考价值.

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