甲状旁腺素对去势雌性小鼠骨折愈合的影响

李伟龙，孟越，余霄，庞清江

甲状旁腺素（PTH）是公认的促骨形成药物[1]。既往研究表明，PTH可以显著增加小鼠股骨、胫骨和全身的骨密度，胫骨骨矿物含量也明显增加[2]。在一项大样本的临床研究中，PTH可以显著增加绝经后女性椎体、股骨颈的骨密度，明显降低骨折风险，背痛症状也显著减轻[3]。能否将其促进骨形成的作用运用到骨折愈合期来加速患者的康复是目前的研究热点，但是PTH连续大剂量促进骨吸收和间断小剂量促进骨形成的双向骨调节机制导致PTH并没有达到理想中的效果[4]。本研究将观察不同甲状旁腺素模拟肽对于去势雌性小鼠骨折愈合的影响，为开发基于PTH更有效、副作用更少的促骨形成药物提供理论依据。现报道如下。

1　资料与方法

1.2动物模型的建立 按照经典的切除双侧卵巢的方法建立骨质疏松模型[5]。术后连续3d腹腔注射青霉素（80000U/kg）。将去势的小鼠常规饲养4周后，异氟烷（300 ml/min）吸入麻醉后，左侧大腿备皮、皮肤消毒，参考小鼠股骨骨折模型相关的文献[6]，于左大腿后外侧作1.5 cm的切口，钝性分离肌肉及软组织，暴露股骨，从膝关节处逆行插入直径为0.45mm钢针进行髓内固定，直视下用手术刀（15#）切断股骨中下1/3段部分，造成横行骨折。术毕缝合切口。术后连续3天腹腔注射青霉素（80 000 U/kg），术后定时观察伤口愈合情况。

1.3药物治疗 动物模型建立后，将所有小鼠随机分成3组，每组16只，使用相应的药物进行皮下注射。PTH（1-28）组（400 g/kg），PTH（1-34）组（40 g/kg）及对照组（等剂量0.9%氯化钠注射液），每周5 d，连续4周。本实验的PTH的剂量以文献[7]为参考。在骨折术后的2周和4周分别处死各组小鼠8只，收集左侧股骨进行检测。

1.4骨痂处Micro-CT检查 将左侧股骨分离，剥离周围的软组织及肌肉，并拔除钢针，将整段股骨浸泡在10%的甲醛48 h，后取出放在 70%的酒精保存在4℃，取左侧股骨进行 Micro-CT扫描（skyscan1176，Bruker，USA），股骨用湿润的纸巾包裹，放入样本扫描固定器中，确保股骨长轴和扫描器长轴一致，扫描参数设定：选定全部骨痂区域，50kV，98 A，每层厚度9 m，扫描结束后运用Micro-CT自带软件进行新生骨痂区域的选定，并对以下参数进行量化统计：骨密度（BMD）、骨体积（BV）、相对骨体积（BV/TV）、平均骨小梁厚度（Tb.Th）。

1.5生物力学检测 进行骨 Micro-CT扫描后的股骨，进行三点弯曲测试。选取支点跨距为6mm，在骨痂中点处垂直施加载荷，速率为2mm/min。发生骨折时记录下最大力，根据力与位移曲线计算出刚度。本实验过程均由试验机（Instron E1000，Instron，Norwood，MA，USA）自带软件进行记录、分析。

1.6统计方法 采用SPSS20.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析或LSD-检验。＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1BMD值 术后2周和4周，PTH（1-34）组的BMD值均高于PTH（1-28）组和对照组，差异均有统计学意义（=3.56、12.48，均＜0.05）；术后 4 周，PTH（1-28）组的BMD高于对照组，差异有统计学意义（=2.32＜0.05）。见表 1。

2.2Micro-CT数据 术后2周和4周，PTH（1-28）组和 PTH（1-34）组的 BV 值均高于对照组（均＜0.05）；从术后2周、4周，每组的BV值均逐渐在下降，且PTH（1-28）组和 PTH（1-34）组的 BV 值在各个时间点差异均有统计学意义（均＜0.05）。见表2。

目前淮山的加工产品主要有鲜切淮山、速冻淮山、淮山干制、淮山果蔬复合饮料、淮山保健酸奶、淮山焙烤食品、速溶淮山粉等。

术后2周和4周，PTH（1-34）组的BV/TV值均高于对照组（=3.51、4.10，均＜0.05）；术后2周，对照组与 PTH（1-28）组的BV/TV差异无统计学意义（=1.33＞0.05）；术后 4 周，PTH（1-34）组与PTH（1-28）组的BV/TV差异有统计学差异（=2.53＜0.05）。见表3。

术后2周和4周，PTH（1-28）组和PTH（1-34）组的Tb.Th值均高于对照组（均＜0.05）；PTH（1-34）组与PTH（1-28）组的术后2周Tb.Th差异无统计学意义（=2.01，＞0.05）；两组术后4周Tb.Th差异有统计学意义（=3.08，＜0.05）。见表4。

2.3生物力学数据 术后2周和4周，PTH（1-28）组和 PTH（1-34）组的刚度和最大力均明显高于对照组（≥17.017，均＜ 0.05）；术后 2 周，PTH（1-34）组的刚度(10.1±0.8)N/m 和最大力（5.0±0.7）N 均明显高于PTH（1-28）组的刚度（8.6±0.7）N/m 和最大力（4.3±0.5）N（ =2.60、3.82，均＜ 0.05）；术后 4 周，PTH（1-34）组的刚度（17.0±2.8）N/m和最大力（8.9±1.1）N均明显高于 PTH（1-28）组的刚度（14.2±2.7）N/m和最大力（7.0±1.0）N（=2.41、4.26，均＜0.05)。

3　讨论

雌性小鼠切除双侧卵巢制作骨质疏松模型已广泛应用于骨折愈合领域的研究[5]，本文参考相关的小鼠骨折模型的建立方法[6]，对去势小鼠行股骨中下1/3段横行截骨，成功制作骨质疏松性骨折的小鼠模型。

PTH对维持人体内钙磷调节的平衡起到重要作用，2002年美国FDA批准低剂量PTH间断性皮下注射治疗骨质疏松[7]，2010年PTH被批准进入中国市场，治疗女性绝经后重度骨质疏松。有数据统计显示，年纪大于50岁的白种人群中，有50%的女性和20%的男性在今后的一生中会发生脆性骨折[8]。因此，如何将其有效地应用到骨质疏松性骨折的患者中是目前临床和基础研究的热点。但是由于PTH的双向调节作用使PTH的促骨形成作用并没有达到预期的疗效[4]。这主要是由于 PTH可以通过激活PTHR1受体（G蛋白结合受体），从而激活多个信号通路，目前与成骨相关的几个信号通路包括cAMP/PKA、PLC/PKC和非PLC/PKC信号通路[9]。既往研究显示，cAMP/PKA信号通路是PTH促进骨形成的主要机制，PLC/PKC没有促进骨形成的作用，主要是辅助cAMP/PKA的破骨作用[10-11]；前期研究发现，非PLC/PKC信号通路可以促进受力区松质骨的形成，进而促进新骨形成[12]。本实验研究显示，PTH（1-34）具有天然的甲状旁腺素的所有活性，可以激活上述三条通路；PTH（1-28）则去除了PTH(29-34)肽段，导致PTH（1-28）只能激活cAMP/PKA和PLC/PKC信号通路[13-14]。

Micro-CT数据显示，术后2周和4周，PTH（1-34）组的BMD值明显均高于PTH（1-28）组，而 PTH（1-28）相比于对照组，也能明显提高骨痂的BMD值（均＜ 0.05）；术后 2 周和 4 周，PTH（1-34）相较于其他组均具有较高的BV/TV值；术后 2周，PTH（1-28）组和PTH（1-34）组具有较高的BV；术后2周和4周，PTH（1-28）组和PTH（1-34）组均具有较高Tb.Th，且PTH（1-34）组均优于PTH（1-28）组（均＜0.05）。表明PTH可以提高骨折部位的骨组织平均密度并增加骨量，同时能够促进骨小梁的微结构的改变，说明PTH可以通过激活PTHR1受体促进小鼠骨折部位骨痂的形成和重塑[15]。同时，PTH（1-28）组在促进骨折愈合方面也具有较好的功效，可能是由于PTH（1-28）激活了能产生主要促骨形成作用的 cAMP/PKA信号通路，PTH（1-34）组在促进骨量增加方面优于PTH（1-28）组（＜0.05），鉴于该两种甲状旁腺素模拟肽激活的通路的差异，推测两种模拟肽在骨折愈合的差别可能是由于PTH（1-34）在激活cAMP/PKA和PLC/PKC信号通路的基础上，还能额外激活非PLC/PKC信号通路以增加骨痂的骨量和骨密度。

骨折愈合是一个十分复杂的过程，受到自身和外界等多方面因素的影响，骨折愈合的临床标准除了骨痂的连续和骨折线的模糊，还需要骨折部位恢复到一定的强度。本组术后2周和4周，PTH（1-34）组和PTH（1-28）组的刚度和最大力均明显高于对照组，且PTH（1-34）组优于 PTH（1-28）组（均＜ 0.05）。可见PTH（1-34）和 PTH（1-28）均可恢复骨折力学稳定和强度，而PTH（1-28）在恢复力学稳定上稍差于PTH（1-34）。结合之前的Micro-CT结果，推断PTH在促进骨折愈合过程中之所以具有较好的生物力学性能，在早期，可能是通过增加骨量来增强骨痂的力学性能，到了后期则主要通过对骨痂的改建和重塑来恢复骨折处骨痂的力学；而鉴于PTH（1-34）组的生物力学性能亦明显优于 PTH（1-28）组，故推断可能是PTH（1-34）通过非PLC/PKC信号通路能够在骨质疏松性骨折的愈合过程中对骨微结构进行改建和重塑以恢复骨折的力学稳定及强度。

表1　术后2周和4周3组BMD值

表2　术后2周和4周3组BV值 mm3

表3　术后2周和4周3组BV/TV值 %

表4　术后2周和4周3组Tb.Th值 m

本实验也有以下不足之处：一是样本量较少，二是本研究的观察时间只有4周。PTH对于骨质疏松性骨折愈合的后期疗效如何还有待更长时间的研究观察。

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