云南省部分地区规模猪场猪伪狂犬病流行病学调查

苏琳琳，朱　丽，钱祁昇，赵翔玥，吕念词，郑晓琳，张天羽，柴　俊，张以芳

（云南农业大学动物医学院动物健康检测与评价云中心，云南昆明　650201）

猪伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起猪的一种急性高死亡率传染病[1]，传播速度快，致病性强，危害严重。PRV属于疱疹病毒科（Herpesviridae）α疱疹病毒亚科[2]。PR属于自然疫原性疾病，被我国列为二类动物疫病，被世界动物卫生组织（OIE）列为须通报动物疫病[3]。猪是该病的自然宿主[4]，包括野猪[5-9]。PRV可以通过多种途径在猪群中传播，包括消化道、呼吸道、生殖道，也可以机械传播[10]。为了解云南省猪场中的PR流行情况，从而为预防和控制该病提供数据支持，在云南省部分大中小型猪场随机采样，对采集的血清进行 ELISA检测，对采集的可疑病料进行PCR检测。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1样品 从昆明、曲靖、玉溪、楚雄、大理、宣威、西双版纳等9个地区的54个规模化猪场，随机采集6 555份全血和381份疑似病料（母猪52份、保育猪94 份、公猪精液20份、育肥猪103份、流产胎儿和仔猪112 份）。

1.1.2试验材料 猪伪狂犬病 gE-ELISA、gBELISA 诊断试剂盒（美国 IDEXX 公司）；Mini BEST viral RNA/DNA extraction kit ver 5.0（Takara大连宝生物公司）；2×Easy SuperMix（大连宝生物公司）；胶回收试剂盒（全式金）；ddH2O（大连宝生物公司）。

1.2　方法

1.2.1血清学检测 将采集的6 555份全血处理后，取其血清，根据猪伪狂犬病gE-ELISA诊断试剂盒使用说明进行抗体检测。在阴、阳性对照成立的前提下，如果待检样品的S/N值≤0.60，判定为PRV gB（gE）抗体阳性；如果待检样品S/N值＞0.7，判定为PRV gB（gE）抗体阴性。

1.2.2病原学检测 将冻存的组织样品（主要是脾脏、淋巴结，少量为脑组织）取出，置室温解冻；在超净工作台中，用灭菌剪刀、镊子剪至米粒大小，然后转移至预先灭菌处理好的研钵中，加入液氮研磨；最后分装到2 mL灭菌离心管中，-70 ℃冻存待检。

1.2.3引物设计 根据GenBank中的PRV核苷酸序列，应用DNAStar软件设计1对引物（PRV-F、PRV-R）。引物由（华大基因）合成。引物信息见表1。

表1　PRV引物

1.2.4样品DNA提取 根据 Mini BEST viral RNA/DNA extraction kit ver 5.0 试剂盒使用说明进行样品DNA提取。

1.2.5PCR扩增 取1 μL所提DNA作为模板，加入12.5 μL 2X Easy Taq SuperMix、9.5 μL dd H2O、1 μL PRV-F、1 μL PRV-R。反应体系为：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，34个循环；终延伸72 ℃ 5 min。

1.2.6PCR产物纯化测序 对PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后，根据试剂盒说明书做胶回收目的条带，然后克隆转化；将回收产物将送至华大基因进行测序鉴定。

2　结果

2.1　血清学检测

2.1.1不同年份 2016—2017年在云南省不同地区采集的6 555份血清样品中，PRV gB抗体阳性率为88.7%，gE抗体阳性率（野毒感染率）为13.5%（表2）。

表 2　不同年份PRV抗体检测结果

2.1.2不同地区 检测结果显示：楚雄市的gB抗体阳性率最低，为78.5%，但gE抗体阳性率（野毒感染率）最高，为21.8%；大理市gB抗体阳性率最高，为95.1%，但野毒感染率最低，为6.0%（表3）。

表3　不同地区PRV抗体检测结果

2.1.3不同季度 检测结果显示，第2季度的野毒感染率最高，为20.3%，第1季度最低，为8.7%。不同季度的PRV抗体检测结果见表4。

表 4　不同季度PRV抗体检测结果

2.2　病原学检测

2.2.1不同年份 对不同年份送检的疑似PR病料进行 PCR 检测，发现2016、2017年的病原检出率分别为 22.1%、23.7%，表明云南省的PRV野毒感染较严重（表5）。对送检病料的PCR检测鉴定结果见图1。

表5　不同年份送检病料PCR检测结果

图1　部分病料的PCR扩增结果

2.2.2不同地区 对2016—2017年云南省不同地区送检的疑似病料进行PCR 检测，发现玉溪市病原检出率最高（52.6%），德宏市最低（16.4%）。具体检测结果见表6。

表6　不同地区送检病料PCR检测结果

2.2.3不同季度 对不同季度送检的疑似PRV 感染病料进行 PCR 检测，发现各季度的病原检出率较为均衡，在20%～30%之间。具体结果见表7。

2.2.4不同猪群 对云南省不同地区送检的不同生产阶段猪群病料进行 PCR检测。检测结果显示，母猪的病原检出率最高（28.8%），而育肥猪最低（20.4%）。具体结果见表8。

表7　不同季度送检病料PCR检测结果

表8　不同生产阶段猪群病料 PCR 检测结果

3　分析与讨论

目前，我国应用 PRV gE基因缺失活疫苗来控制该病。因此，猪血清中检出gE抗体可确诊为野毒感染[11]。本次调查发现，2016、2017年的PRV gE抗体阳性率分别为13.2%、13.8%，疑似样品的病原检出率分别为22.1%、23.7%。该结果与杨珊珊[12]等报道的2016年江苏省部分地区PR样本阳性率（43.2%），以及毕俊龙[13]等报道的2009—2013 年云南省楚雄地区规模场PR样本阳性率（37.67%）相比偏低，而接近于邹敏等[14]报道的2012—2013 年全国18 个省份393 个猪场检出PRV gE抗体总体阳性率（16.13%）。这表明云南省内的PR流行仍然严重，因而要提高对PR防控的重视，认真做好预防控制工作，将可能产生的损失降低到最小。

从不同地区的检测结果来看，玉溪、宣威和西双版纳的PRV野毒感染率较高，表明这3个地区的PR发生风险较大。从不同季度样品检测结果来看，4个季度的野毒感染率较为接近，说明PR一年四季均可发生，没有明显的季节性，只是在初春和冬季较为多发。从不同猪群检测结果来看，母猪野毒感染率较高，说明在云南省存在较为严重的PR野毒感染。这可能与疫苗质量、免疫程序、接种方法和养殖户对免疫的错误认识有关。保育猪野毒阳性率高可能与母源抗体的干扰有关，也可能与母猪垂直传播有关；仔猪由于免疫系统还没有发育成熟，对PRV的抵抗力较弱。因此，母猪和仔猪的PR免疫与预防工作都应该得到重视。

4　结论

本次调查发现，云南省9个地区规模猪场的PR免疫抗体阳性率为88.7%，表明总体免疫效果较好；gE抗体阳性率为13.5%，表明云南省仍有一定程度的PR流行；gB抗体阳性率偏高的地区，gE抗体阳性率较低，说明免疫有助于预防PR野毒感染；第2季度野毒感染率最高，说明PR多发于低温季节；玉溪、宣威和西双版纳等地区，以及母猪、保育猪、仔猪和公猪精液的PR病原检出率较高，表明对于这些地区、此类猪群，应重点加强防控。

参考文献：

[1] 马沛，王和平. 猪伪狂犬病的流行情况及净化对策[J].湖南畜牧兽医，2013（4）：23-25.

[2] SKODA R. Detection of neutralizing antibodies against the Aujeszky disease virus in swine in Southern Germany[J]. Berl munch tierarztl wochenschr，1971，84（21）：411-414.

[3] 杨毅. 猪伪狂犬病疫苗的研究进展[J]. 江西农业学报，2010（3）：154-157.

[4] 邓仕伟，薛春芳，汪勇. 我国规模化猪场对猪伪狂犬病的控制[J]. 中国畜牧兽医，2007（2）：112-115.

[5] LOUKACHOV I I，NIKITINE N G. Aujeszky disease in U.S.S.R[J]. Bulletin-of fi ce international des epizooties，1968，69（11）：2151.

[6] VESELINOVA A，MOTOVSKI A. Several features of Aujeszky disease virus[J]. Veterinarno-meditsinski nauki，1976，13（7）：9-15.

[7] MÜLLER T，KLUPP B G，FREULING C，et al.Characterization of pseudorabies virus of wild boar origin from Europe[J]. Epidemiology and infection，2010，138（11）：1590-600.

[8] MÜLLER T，KLUPP B G，FREULING C，et al.Pseudorabies virus in wild swine：a global perspective[J].Archives virology，2011，156（10：1691-705.

[9] MAHMOUD H Y，SUZUKI K，TSUJI T，et al.Pseudorabies virus infection in wild boars in Japan[J].Journal of veterinary medical science，2011，73（11）：1535-1537.

[10] CORN J L，STALLKNECHT D E，MECHLIN N M，et al. Persistence of pseudorabies virus in feral swine populations[J]. Journal of wildlife diseases，2004，40（2）：307-310.

[11] TONG W，LI G，LIANG C，et al. A live，attenuated pseudorabies virus strain JS-2012 deleted for g E/g I protects against both classical and emerging strains[J].Antiviral research，2016，130：110-117.

[12] 杨珊珊，徐璇，孙涛，等. 2016年江苏省部分猪场猪伪狂犬病血清流行病学调查[J]. 中国动物检疫，2017，34（8）：17-19.

[13] 毕峻龙，杨培昌，肖俊，等. 2009—2013 年云南省楚雄地区猪伪狂犬血清流行病学调查和防控措施研究[J]. 动物医学进展，2015，36（4）：117-120.

[14] 邹敏，杨旭兵，郑辉，等. 2012—2013年我国部分地区猪伪狂犬病流行病学调查[J]. 中国动物检疫，2015，32（4）：1-5.