脑源性神经生长因子对缺糖缺氧小鼠伏隔核胶质纤维酸性蛋白的影响

喻晓路　林奇泗　傅　慧

1)徐州医科大学江苏省麻醉学重点实验室，江苏 徐州 221004　2)徐州医科大学药学院，江苏 徐州 221004　3)淄博市第一医院神经内一科，山东 淄博 255200

星形胶质细胞(astrocyte，AS)是中枢神经系统中数目最多的一种细胞，作为胶质细胞的主要类别，几乎囊括了胶质细胞的所有功能[1-2]。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)被公认为是AS的标志性蛋白，在感染、创伤、神经退行性疾病等病理条件下，星形胶质细胞被激活，因此，抑制星形胶质细胞过度激活对防治中枢神经系统疾病有重要意义[3-4]。脑源性神经生长因子(brain derived neurotropic factor，BDNF)是一种重要的神经因子，在生理环境下具有促进突触的形成、维持神经系统的功能[5-8]。伏隔核(nucleus accumbens，NAc)是中脑-边缘多巴胺系统环路的重要核团，NAc具有行为调控、镇痛作用，参与精神分裂症的产生、药物成瘾、学习记忆和调节心血管活动及运动活动等[9-10]。脑组织的缺糖缺氧是脑缺血患者的主要症状之一，其中脑组织中的星形胶质细胞会大量增生，是一种缺血后的全脑保护性防御机制[11-17]。我们对比了脑片培养技术和细胞培养技术，认为脑片培养技术与细胞培养技术相比更多地保留了细胞和组织结构，能够更好地模拟生理状态，且操作更简便，对实验设备的要求也不高[18-23]。2017-12—2018-02在徐州医科大学麻醉学重点实验室，18只小鼠随机分为3组，对小鼠NAc脑区的脑片进行缺糖缺氧处理和复灌，并与加入BDNF的处理组进行比较，对GFAP蛋白的表达量进行测定，明确BDNF在缺糖缺氧条件下小鼠NAc脑区的作用，以期为脑缺血溶栓治疗提供有力的实验依据。

1　材料与方法

1.1主要材料

1.1.1实验动物：SPF级昆明小鼠18只，体质量25～30 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，标准化饲养。

1.1.2仪器和试剂：①材料：BDNF(2837)购自TOCRIS公司，RIPA裂解液(KGP702-100)、苏木素-伊红(H-E)染液(KGA224)购自凯基生物公司，低糖DMEM培养基(ABB210359)和EBSS培养基(AB10134597)均购自HyClone公司，青链霉素混合液(VC2003)购自VICMED公司，GFAP(12389)一抗购自Cell Signaling Technology公司，GAPDH(10494)一抗购自proteintech公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(A0208)和BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009)购自碧云天生物技术有限公司，ECL发光试剂盒(AC36131)购自bioworld 公司，Transwell 24孔板细胞培养小室(3413)购自Corning公司，PVDF膜(IPVH00010)购自Immobilon公司，自动震动切片机购自莱卡公司，化学发光仪购自BIO-RAD公司，其余自配液体试剂均购自sigma公司。②自配溶液：高渗糖溶液Sucrose 254 mmol/L，D-Glucose 10 mmol/L，NaH2PO41.25 mmol/L，NaHCO324 mmol/L，MgSO47·H2O 2 mmol/L，KCl 3 mmol/L，CaCl22·H2O 2 mmol/L，用去离子水溶解。使用前通入95% O2+5% CO230 min。

1.2实验方法

1.2.1脑片制备：实验动物经七氟烷诱导麻醉后，迅速断头，然后用剪刀剪开两耳间的皮肤直至两鼻间，然后翻转皮肤，暴露颅骨。用眼科剪去掉小鼠颅骨，暴露全脑。随后用眼科镊伸入脑前端下部的嗅球处，轻轻挑起脑的前端，剪断脑神经，翻转全脑，放入冰冷、预先通95% O2+5% CO2混合气 30 min的高渗糖溶液中，放置1～2 min。取出全脑，除去小脑和嗅球，用刀片切取鼠脑前中部，迅速用502胶水将脑组织块底部粘在自动震动切片机的缓冲槽中，用高渗糖溶液浸没组织块，设置自动震动切片机的切片速度、厚度和距离，切取含有NAc脑区的厚度为300 μm的脑片，可以取3～5片，用小刀切去多余组织，只保留NAc区域，整个过程在8 min内完成，高渗糖溶液温度维持在4 ℃。24孔培养板孔内加0.5 mL的脑片培养液，即低糖DMEM培养基，其中包括1%青链霉素混合液，将取好的脑片移入Transwell的小室中，尽量完全吸弃高渗糖溶液，将小室放入培养板中，使培养基的液面刚好达到脑片的水平，但不漫过脑片，将培养皿置于37 ℃培养箱中的自制密闭容器中，自制密闭容器有输入和输出气体的导管。脑片培养基的组成：低糖DMEM+1%的青链霉素混合液。脑片的培养条件：温度37 ℃，持续稳定通入95% O2+5% CO2混合气体，微生物培养箱中培养。要保证脑片的上表面充分暴露于气体环境中。本实验所采用的脑片培养方法，目前此方法在本实验室已经成熟，如图1中神经元形态清晰。

1.2.2充N2法制备脑片缺氧缺糖模型：将缺氧缺糖组的脑片更换为EBSS培养基，并移进充入5% CO2+95% N2混合气体的密闭容器中，在37 ℃培养箱中以0.5 L/min的流量充入混合气，于15 min后换成低糖培养基并复氧，通入95% O2+5% CO2混合气体，在37 ℃培养箱中复灌培养1 h。

1.2.3分组：18只正常昆明小鼠随机分为3组，分别为正常组、缺糖缺氧复灌组(OGD/R)和缺糖缺氧复灌给药组(OGD/R+BDNF)各6只。见图2。正常组：选取正常昆明小鼠6只，取NAc脑区，采用低糖DMEM培养基并通入95% O2+5% CO2混合气体进行培养。缺糖缺氧复灌组(OGD/R)：选取正常昆明小鼠6只，取NAc脑区，采用EBSS培养基并通入5% CO2+95% N2混合气体培养15 min，并进行复灌，即将带有脑片的小室置入带DMEM培养基的培养皿中，并持续通入95% O2+5% CO2混合气体1 h。缺糖缺氧复灌给药组(OGD/R+BDNF)：选取正常昆明小鼠6只，取NAc脑区，在EBSS培养基中加入BDNF(BDNF用量为50 ng/μL)并通入5% CO2+95% N2混合气体培养15 min，并进行复灌，即将带有脑片的小室置入带DMEM培养基的培养皿中，并持续通入95% O2+5% CO2混合气体1 h。

图1　脑片培养NAc脑区HE染色(20×)

图2　小鼠脑片OGD分组

1.2.4对检测样品的制备和免疫印迹分析：在模型制作完成后，将脑片移入洁净的EP管中，加入蛋白裂解液，用电动匀浆器将组织打碎，充分裂解组织，4 ℃ 10 000 r/min离心30 min，弃去沉淀，将上清液移入新EP管中，并做好标记。用BCA试剂盒进行蛋白定量，测定蛋白浓度，将样品配平，按照每孔20 ng的蛋白量进行上样跑电泳，采用半干转的方式将胶中的蛋白转到PVDF膜上，5%的脱脂奶粉封闭1 h，移入GFAP(1∶1 000)一抗和GAPDH(1∶5 000)一抗中4 ℃过夜，室温复温30 min，washing buffer清洗3次，每次5 min，转入HPR标记的兔二抗中孵育40 min，washing buffer 清洗3次，每次15 min。用化学发光仪进行曝光记录，ImageJ软件进行定量分析。

1.3统计学处理采用统计学软件SPSS 13.0处理数据，采用单因素方差分析(one-way ANOVE)进行组间比较，P<0.05 为差异有统计学意义。

2　结果

正常组GFAP蛋白的相对表达量为0.544±0.053，缺糖缺氧复灌组GFAP蛋白的相对表达量为1.439±0.325，缺糖缺氧复灌给药组GFAP蛋白的相对表达量为0.739±0.121。与正常组相比，缺糖缺氧复灌组GFAP蛋白的相对表达量升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与缺糖缺氧复灌组相比，缺糖缺氧复灌给药组GFAP的蛋白相对表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与正常组相比，缺糖缺氧复灌给药组GFAP的蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

注：与正常组比较，**P<0.01；与OGD/R组比较，#P<0.05图3　GFAP表达水平比较

3　讨论

脑部缺糖缺氧是脑缺血的主要症状，可导致残疾或死亡。众多研究表明，脑组织的缺糖缺氧会诱发一系列的病理变化，甚至短暂性的缺糖缺氧也会对脑组织造成一定的损伤[8]。脑组织主要由神经元和神经胶质细胞组成，神经胶质细胞的数量是神经元的10～50倍，其中大部分为星形胶质细胞[1-3]。有报道称BDNF具有神经保护和神经营养的作用，可以帮助神经损伤后传导功能的恢复。在与行为、疼痛、精神分裂症、药物成瘾、学习记忆和心血管活动及运动活动等功能密切相关的NAc脑区，缺糖缺氧对脑组织的损伤表现在星形胶质细胞的大量增生上，造成此脑区的损伤会影响多个生理功能。在缺糖缺氧的条件下加入BDNF，能有效减缓GFAP蛋白表达量的升高。采用建立NAc脑区脑片缺糖缺氧模型，很好地模仿了短暂性脑缺血的症状，同时加入BDNF的实验，验证了BDNF在短暂性缺糖缺氧对NAc脑区GFAP蛋白的作用，说明BDNF可以有效降低GFAP蛋白的表达量，抑制星形胶质细胞的活化，减少炎性因子的释放，从而减少神经元的损伤[24]。

现有报道显示，BDNF作为一种重要的脑源性神经生长因子，对脑内神经元起到很好的保护和营养作用，其中也包括NAc脑区，将BDNF注入老年大鼠伏隔核可以改善认知和结构突触可塑性[25-26]。关于GFAP蛋白在NAc的研究，目前只有文献报道过疼痛和抑郁症方面[27-28]。有文献报道白藜芦醇对于缺糖缺氧海马脑区有保护作用，与本实验有相似之处，却未对GFAP蛋白相对表达量进行检测[29]。此实验对于由脑缺血所造成的缺糖缺氧症状而引起的星形胶质细胞增多，从而造成神经元的损伤，验证了BDNF对星形胶质细胞的抑制作用，以上内容未报道过，我们的研究正好填补了这一空白。本实验给BDNF的临床应用提供了实验依据，若对BDNF的作用机制和作用效果进行更进一步的研究，将会改善由于脑缺血造成的神经系统疾病的治疗方法，应用前景非常广阔。

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