转染miRNA-129-5p对MCF-7细胞化疗敏感性及ABCB1表达的影响

石　瑛，王云凤，路　璐，任静静，马　丹，魏园玉

1)郑州大学第三附属医院检验科 郑州 450052　2)郑州大学检验系 郑州 450052

紫杉醇是乳腺癌化疗的常用药物，但化疗中常常会出现肿瘤细胞对紫杉醇敏感性降低并最终导致多药耐药(multidrug resistance，MDR)，是乳腺癌治疗失败、患者死亡的重要原因之一[1-2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一种非编码RNA,可以同时作用于一种或多种靶mRNA, 根据互补方式的不同降解靶mRNA或者抑制其蛋白的翻译，并在肿瘤细胞的增殖、凋亡或转移等生物学行为中发挥重要作用。越来越多的研究[3-7]指出：miRNA-129-5p不仅与胃癌、肝癌、喉鳞状细胞癌等多种肿瘤的发生与发展有关，同时还参与逆转肿瘤MDR。通过靶基因预测(http://www.targetscan.org；http://www.mirbase.org)，miRNA-129-5p可能直接靶向MDR相关基因三磷酸腺苷结合盒式结构(ATP-binding cassettes,ABC)转运蛋白ABCB1。Wu等[8]亦在胃癌细胞系SCG细胞中通过荧光素酶报告基因实验证实ABCB1是miRNA-129-5p的直接靶基因，且过表达miRNA-129-5p能够提高胃癌细胞对长春新碱和阿霉素的药物敏感性。本研究以乳腺癌MCF-7细胞为研究对象，观察转染miRNA-129-5p的MCF-7细胞对紫杉醇药物敏感性的变化，同时观察MCF-7细胞凋亡相关因子和ABCB1表达的变化，为提高肿瘤化疗疗效提供新的思路和手段。

1　材料与方法

1.1主要试剂与仪器MCF-7细胞购自美国ATCC细胞库。紫杉醇购自西安昊轩生物科技有限公司，兔抗人Bcl-2和Bax 多克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology(CST)公司，鼠抗人ABCB1多克隆抗体、兔抗人GAPDH多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠和羊抗兔IgG、脂质体转染试剂LipoHigh、总mRNA和miRNA 提取与检测试剂盒等均购自生工生物工程(上海)有限公司，CCK-8购自日本同仁化学研究所，细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。超灵敏多功能成像仪(Amersham Imager 600)购自美国GE公司，流式细胞检测仪(BD FACSCanto)购自美国BD公司，全自动荧光定量PCR仪(ABI 7500)购自美国ABI公司。

1.2细胞培养将MCF-7细胞接种于含体积分数10%灭活胎牛血清的RPMI 1640完全培养基中，37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养，待细胞处于对数生长期且融合率达80%～90%时，用于后续实验。

1.3紫杉醇处理和细胞增殖活性检测取处于对数生长期的细胞，消化后以8×103个/孔接种于96孔板，待细胞贴壁生长且融合度达到60%～70%分别转染miRNA阴性对照(miRNA-NC)和miRNA-129-5p。转染24 h后分别加入1.95、3.90、7.81、15.63、31.25、62.50、250.00 nmol/L紫杉醇继续培养48 h，收获细胞,采用CCK-8法检测细胞增殖情况。细胞增殖抑制率=1-(药物处理组A450 nm-调零孔A450 nm)/(对照组A450 nm-调零孔A450 nm)×100%。每个药物浓度组设置5个平行复孔，实验重复3次。

1.4细胞分组与转染取处于对数生长期的细胞，用胰蛋白酶消化后按3×105个/孔接种于6孔板， 当细胞融合率达70%～80%后分组：空白对照组(常规培养，不做任何处理)、转染试剂组(仅给予转染试剂LipoHigh)、miRNA-NC组(转染miRNA-NC)、miRNA-NC+紫杉醇组、miRNA-129-5p组(转染miRNA-129-5p)和miRNA-129-5p+紫杉醇组。转染实验严格按照操作说明书进行，miRNA-129-5p及miRNA-NC阴性对照终浓度均为30 nmol/L，依据预实验筛选结果，紫杉醇浓度和作用时间取7.81 nmol/L和48 h。

1.5miRNA提取与qRT-PCR采用miRNA抽提试剂盒提取空白对照组、转染试剂组、miRNA-NC组和miRNA-129-5p组细胞miRNA，所有步骤严格按照操作说明书进行。miRNA-129-5p引物序列如下：上游引物5’-CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC-3’；下游引物5’-AAGCCCAGACCGCAAAAAGUU-3’。U6作为内参。逆转录条件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min；PCR反应体系为20 μL；扩增条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。按2-ΔΔCt方法分析miRNA-129-5p 的相对变化量。每个实验组设置3个平行复孔，实验重复3次。

1.6各组细胞凋亡检测用不含EDTA的胰蛋白酶消化按1.4中分组处理的6组细胞后，用预冷的PBS洗涤1次。加入 Binding buffer重悬细胞，调整细胞密度为106mL-1，每组取100 μL细胞悬液并分别加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，室温避光15 min；处理后的标本于30 min内上机检测。采用BD FACSDiva 8.0软件分析数据。计算早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率。每个实验组设置3个平行复孔，实验重复3次。

1.7各组细胞ABCB1、Bcl-2及BaxmRNA检测

提取6组细胞总mRNA，所有操作严格按照试剂盒说明书进行。引物(表1)由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR反应体系为25 μL，扩增条件： 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。以GAPDH作为内参，按2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。每个实验组设置3个平行复孔，实验重复3次。

1.8各组细胞ABCB1、Bcl-2及Bax蛋白检测用RIPA细胞裂解液裂解各组细胞总蛋白，与5×蛋白上样缓冲液以体积比41混匀，煮沸5 min，冰上放置10 min。120 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将分离的蛋白转到PVDF膜，放入含50 g/L脱脂奶粉的封闭液中室温封闭1 h后，分别加入鼠抗人ABCB1多克隆抗体(按1500稀释)，兔抗人Bcl-2、Bax、GAPDH多克隆抗体(均按11 000稀释)，4 ℃过夜；次日TBST洗涤PVDF膜，分别加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h；TBST再次洗膜， ECL显色，采用Image J软件分析目的蛋白与GAPDH条带灰度值的比值，作为目的蛋白的相对表达量。实验重复3次。

表1　目的基因引物序列及扩增产物长度

F:上游引物；R：下游引物

1.9统计学处理采用SPSS 23.0处理数据。采用单因素方差分析比较6组MCF-7细胞凋亡及ABCB1、Bcl-2和Bax mRNA及蛋白表达水平的差异，两两比较用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2　结果

2.1miRNA-129-5p对紫杉醇作用下MCF-7细胞增殖的影响结果见表2。

2.2不同组别miRNA-129-5p的相对含量空白对照组、转染试剂组、miRNA-NC组和miRNA-129-5p组miRNA-129-5p的相对含量分别为：(1.00±0.07) 、(0.93±0.03)、 (1.01±0.06)、(140.67±0.13),4组间相比，差异有统计学意义(F=21.6×105，P<0.001)，与其他3组相比，miRNA-129-5p组miRNA-129-5p的相对含量上调近140倍，说明miRNA-129-5p可以有效转染入MCF-7细胞。

2.3miRNA-129-5p对紫杉醇作用下MCF-7细胞凋亡的影响与其他各组比较，miRNA-129-5p+紫杉醇组MCF-7细胞早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率均明显提高，见表3。

2.4各组MCF-7细胞中ABCB1、Bcl-2和BaxmRNA及其蛋白的表达情况见图1，表4、5。P-gp是由ABCB1基因编码的药物转运蛋白。实验结果表明：与其他各组比较，miRNA-129-5p+紫杉醇组MCF-7细胞中ABCB1和Bcl-2 mRNA及蛋白的相对表达量降低；而Bax mRNA及蛋白的相对表达量升高。

表2　miRNA-129-5p对紫杉醇作用下MCF-7细胞增殖抑制率的影响(n=3)　%

表3　各组细胞凋亡率的比较(n=3)　%

*：与A、B、C组比较，P<0.05；#：与A、B、C、D组比较，P<0.05；△：与其他5组比较，P<0.05

表4　各组细胞ABCB1、Bcl-2和Bax mRNA的相对表达量(n=3)

*：与A、B、C组比较，P<0.05；#：与A、B、C、D组比较，P<0.05；△：与其他5组比较，P<0.05

1：空白对照组；2：转染试剂组；3：miRNA-NC组；4：miRNA-NC+紫杉醇组；5：miRNA-129-5p组；6：miRNA-129-5p+紫杉醇组图1　各组MCF-7细胞中P-gp、Bcl-2和Bax蛋白的表达

表5　各组细胞P-gp、Bax和Bcl-2蛋白的相对表达量(n=3)

*：与A、B、C组比较，P<0.05；#：与A、B、C、D组比较，P<0.05；△：与其他5组比较，P<0.05

3　讨论

紫杉醇是重要的抗肿瘤一线化疗药物，而肿瘤细胞耐药是导致化疗失败的主要原因之一。近年来的研究[3]表明miRNAs与肿瘤耐药密切相关。已知miRNA通过靶向调控耐药相关基因的表达提高肿瘤细胞对化学药物的敏感性，逆转耐药并诱导细胞凋亡[9-11]。miRNA-129-5p是定位于染色体7q32的miRNA-129-1和11p11.2的miRNA-129-2的共同转录产物，其在多种肿瘤细胞，尤其是耐药肿瘤细胞株中表达明显降低[12-14]。而过表达的miRNA-129-5p具有逆转抗肿瘤药物耐药性的作用[15-16]，但是其机制尚不明确。

ABCB1是 ABC转运蛋白超家族的一员，P-gp是由ABCB1基因编码的经典的药物转运蛋白，起到药物泵的作用，P-gp过表达可导致药物外排，降低细胞内有效药物浓度，同时调节细胞增殖、凋亡和分化等，从而介导肿瘤细胞对紫杉烷类药物的耐药[17-18]。靶基因预测与Wu等[8]的研究报道进一步说明miRNA-129-5p可能直接靶向MDR相关基因ABCB1，致ABCB1 mRNA及其蛋白表达受到抑制而提高肿瘤细胞中有效药物浓度，发挥逆转耐药的作用。

本研究采用脂质体转染技术使MCF-7细胞miRNA-129-5p过表达后用紫杉醇处理，发现细胞增殖抑制率升高，细胞凋亡增多，说明调控miRNA-129-5p在MCF-7细胞中的表达可提高乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性。

Bcl-2和Bax是重要的凋亡相关基因[19-20]。进一步的分析显示，与miRNA-NC+紫杉醇组相比，miRNA-129-5p+紫杉醇组细胞ABCB1的表达降低，凋亡促进基因Bax的表达升高，凋亡抑制基因Bcl-2的表达降低，说明高表达的miRNA-129-5p有可能抑制耐药相关基因ABCB1的表达，从而促进细胞凋亡，提高MCF-7细胞对紫杉醇的敏感性。

综上所述，miRNA-129-5p可能通过下调耐药相关基因ABCB1的表达提高MCF-7细胞对紫杉醇的敏感性，miRNA-129-5p将来有可能用于治疗复发性乳腺癌。

[1] LI W, ZHANG H, ASSARAF YG, et al. Overcoming ABC transporter-mediated multidrug resistance:molecular mechanisms and novel therapeutic drug strategies[J].Drug Resist Updat, 2016, 27: 14

[2] LIANG Z,XI Y.MicroRNAs mediate therapeutic and preventive effects of natural agents in breast cancer[J].Chin J Nat Med,2016,14(12):881

[3] TSAI KW,WU CW,HU LY,et al.Epigenetic regulation of miR-34b and miR-129 expression in gastric cancer[J].Int J Cancer,2011,129(11):2600

[4] MA N,CHEN F,SHEN SL,et al.MicroRNA-129-5p inhibits hepatocellular carcinoma cell metastasis and invasion via targeting ETS1[J].Biochem Biophys Res Commun,2015,461(4):618

[5] LI M,TIAN L,WANG L,et al.Down-regulation of miR-129-5p inhibits growth and induces apoptosis in laryngeal squamous cell carcinoma by targeting APC[J].PLoS One,2013,8(10):e77829

[6] LUAN QX,ZHANG BG,LI XJ,et al.MiR-129-5p is downregulated in breast cancer cells partly due to promoter H3K27m3 modification and regulates epithelial-mesenchymal transition and multi-drug resistance[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2016,20(20):4257

[7] KARAAYVAZ M, ZHAI H, JU J.miR-129 promotes apoptosis and enhances chemosensitivity to 5-fluorouracil in colorectal cancer[J].Cell Death Dis,2013,4:e659

[8] WU Q,YANG Z,XIA L,et al.Methylation of miR-129-5p CpG island modulates multi-drug resistance in gastric cancer by targeting ABC transporters[J].Oncotarget,2014,5(22):11552

[9] HU Y,XU K,YAGÜE E,et al.miR-218 targets survivin and regulates resistance to chemotherapeutics in breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2015,151(2):269

[10]YANG Q,WANG Y,LU X,et al.MiR-125b regulates epithelial-mesenchymal transition via targeting Sema4C in paclitaxel-resistant breast cancer cells[J].Oncotarget,2015,6(5):3268

[11]QIN X,YU S,ZHOU L,et al.Cisplatin-resistant lung cancer cell-derived exosomes increase cisplatin resistance of recipient cells in exosomal miR-100-5p-dependent manner[J].Int J Nanomedicine,2017,12:3721

[12]YU X,LUO L,WU Y,et al.Gastric juice miR-129 as a potential biomarker for screening gastric cancer[J].Med Oncol,2013,30(1):365

[13]DUAN L,HAO X,LIU Z,et al.MiR-129-5p is down-regulated and involved in the growth,apoptosis and migration of medullary thyroid carcinoma cells through targeting RET[J].FEBS Lett,2014,588(9):1644

[14]YANG Y,HUANG JQ,ZHANG X,et al.MiR-129-2 functions as a tumor suppressor in glioma cells by targeting HMGB1 and is down-regulated by DNA methylation[J].Mol Cell Biochem,2015,404(1/2):229

[15]BREST P,LASSALLE S,HOFMAN V,et al.MiR-129-5p is required for histone deacetylase inhibitor-induced cell death in thyroid cancer cells[J].Endocr Relat Cancer,2011,18(6):711

[16]胡俊华,喻琴,杨艳果,等.MiR-129-5p通过靶定胸苷酸合成酶调节结肠癌细胞5-氟尿嘧啶的敏感性[J].临床内科杂志,2014,31(10):709

[17]LOPES-RODRIGUES V,SECA H,SOUSA D,et al.The network of P-glycoprotein and microRNAs interactions[J].Inter J Cancer,2014,135(2):253

[18]GILLET JP,EFFERTH T,REMACLE J.Chemotherapy-induced resistance by ATP-binding cassette transporter genes[J].Biochim Biophys Acta,2007,1775(2):237

[19]CZABOTAR PE,LESSENE G,STRASSER A,et al.Control of apoptosis by the BCL-2 protein family: implications for physiology and therapy[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2014,15(1):49

[20]LI M,YANG Y,KUANG Y,et al.miR-365 induces hepatocellular carcinoma cell apoptosis through targeting Bcl-2[J].Exp Ther Med,2017,13(5):2279