FOXC1在非小细胞肺癌组织中的表达及与预后的关系

石　雁，葛路路，王　静，吴秋歌

郑州大学第一附属医院呼吸内科 郑州 450052

目前，肺癌是全世界病死率最高的恶性肿瘤，5 a生存率约为 18%[1]。其中， 非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌的80%，约70%的患者确诊时已为晚期[2]。肺癌不良的预后与其易浸润转移的生物学特性密切相关,且侵袭转移不仅是病情恶化的标志，还是治疗失败的重要原因[3-4]。叉头框转录因子C1(forkhead box transcription factor C1，FOXC1)是叉头框转录因子家族重要的成员之一，不仅参与了胚胎、眼睛、肢体、肾脏等重要器官的发育，而且在肿瘤的发生发展中也起到了关键作用[5]。研究[6-7]发现，FOXC1可促进乳腺癌、胃癌、肝癌、恶性黑色素瘤等肿瘤细胞的转移及侵袭能力。本研究通过免疫组化法检测了NSCLC组织及相应癌旁正常组织中FOXC1的表达，分析了其表达与患者预后的关系。

1　对象与方法

1.1研究对象选择2012年1月至2013年12月郑州大学第一附属医院术后病理确诊为NSCLC且术前未接受过放化疗及其他治疗的70例患者，收集其石蜡包埋的癌组织及距癌灶2 cm、病理证实为正常肺组织的癌旁组织。其中男52例，女18例；年龄39～77岁；鳞癌30例，腺癌40例；高分化11例，中低分化59例；有淋巴结转移31例，无淋巴结转移39例；TNM分期(UICC2017年修订)Ⅰ～Ⅱ期46例，Ⅲ期24例。所有患者术后1个月内开始接受正规化疗，21 d为1个化疗周期，共4个周期；均未接受放疗、抗血管生成及靶向药物等治疗。化疗方案分别为吉西他滨+奥沙利铂、多西他赛+奈达铂、培美曲塞+奈达铂、吉西他滨+奈达铂、多西他赛+顺铂。

1.2NSCLC及癌旁正常组织中FOXC1的检测采用免疫组化SP法检测。FOXC1羊抗人抗体购自英国Abcam公司，SP-9001免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，DAB显色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。组织标本均经甲醛固定，石蜡包埋，连续3～4 μm切片；切片经二甲苯及梯度乙醇脱蜡水化，0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH=6.0)100 ℃修复抗原，加H2O2阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗，滴加封闭液；滴加一抗(PBS稀释，稀释度1200)4 ℃过夜，室温复温，PBS冲洗，滴加二抗37 ℃孵育30 min；PBS冲洗，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇脱分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。以PBS代替一抗作阴性对照，以已知阳性的肺组织切片作阳性对照。由两位高年资病理科医师双盲阅片。阳性细胞表现为细胞核或胞质黄色或棕褐色着色。于200倍镜下选取10个视野，每个视野计数100个细胞，以阳性细胞百分比和染色强度进行评分[8]。阳性细胞百分比<5%、5%～、26%～、51%～、>75%分别评为0、1、2、3、4分；无染色、淡黄色、棕黄色、棕褐色着色分别评为0、1、2、3分；两项评分相乘，≤3分为低表达，>3分为高表达。

1.3随访对所有患者从术后至2017年4月进行随访观察。电话随访患者的生存情况。患者每21 d于该院行胸部CT、颈部淋巴结、心脏及腹部彩超检查，每3个月行头颅磁共振、全身骨显像检查，胸部CT原发肿瘤病灶长径与短径之和较前增加25%及以上或其他检查提示其他部位出现新的肿瘤病灶或因NSCLC死亡视为疾病进展。随访时间为2～40个月，平均13个月，随访资料完整。

1.4统计学处理采用SPSS 21.0对数据进行统计学分析，癌组织与癌旁正常组织间FOXC1表达的比较采用配对χ2检验，不同病理特征的NSCLC组织中FOXC1蛋白表达的比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线并进行Log-rank检验，检验水准α=0.05。

2　结果

2.1NSCLC组织中FOXC1蛋白的表达见图1、表1。NSCLC组织中FOXC1高表达率为80.0%(56/70)，高于癌旁正常组织25.7%(18/70)。不同病理特征的NSCLC组织中FOXC1蛋白表达情况见表2。

A：肺腺癌组织；B：肺腺癌对应的癌旁组织；C：肺鳞癌组织；D：肺鳞癌对应的癌旁组织图1　FOXC1在NSCLC癌组织及癌旁正常组织中的表达情况(SP,×200)

表1　NSCLC与癌旁正常组织中FOXC1的表达　例

χ2=31.114，P<0.001

表2　不同临床病理特征NSCLC组织中FOXC1表达的比较

2.2FOXC1高表达与低表达的NSCLC患者术后生存曲线的比较FOXC1高表达组中3例失访，1例死于冠心病，1例死于脑出血(非肺癌脑转移瘤破裂)，3例未出现病情进展，余48例患者皆出现病情进展，中位疾病无进展生存期(progression free survival，PFS)为10.5个月；FOXC1低表达组中1例失访，1例死于脑梗死，2例未出现病情进展，余10例患者皆出现病情进展，中位PFS为15.5个月；两组生存曲线(图2)比较，差异有统计学意义(χ2=4.047，P=0.044)。

图2　生存曲线

3　讨论

FOX是一类广泛存在的转录因子，包括19个亚家族[9]，参与胚胎发育、细胞周期调控、组织特异性基因表达、免疫调节、细胞增殖、分化、转移和凋亡等多个生物学过程,其基因突变或表达异常与发育畸形、肿瘤发生相关[10]。FOXC1是FOXC基因亚族成员之一，位于人类染色体6p25，基因全长约3.5 kb，含一个1.6 kb的外显子，编码包含553个氨基酸的蛋白质，在人体肺、心脏、食管、肝、胰腺、膀胱和前列腺等多个组织器官中表达[11]。越来越多的研究发现，FOXC1在肿瘤的发生与进展中扮演着重要的角色。Hayashi等[12]发现FOXC1可通过调控Notch信号通路及与血管内皮生长因子相互作用导致肿瘤的发生。Ray等[13]研究证实，FOXC1高表达的已发生脑转移的基底样细胞乳腺癌患者，颅内无进展生存期缩短，且如果抑制FOXC1基因的表达，乳腺癌细胞的侵袭能力亦减弱。Xia等[14]研究发现，在癌组织中FOXC1高表达的肝癌患者术后复发及发生肺转移的风险更高。

本研究结果显示，FOXC1在NSCLC组织中的表达明显高于癌旁正常组织，FOXC1高表达与患者的年龄、性别、病理类型无关，这与FOXC1在其他系统肿瘤的研究结果相一致。低分化、有淋巴结转移、TNM分期Ⅲ期的NSCLC组织中FOXC1的表达高于高分化、无淋巴结转移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期者，且PFS长于后者，这可能与FOXC1促进肺癌细胞的迁移、浸润能力有关，但其分子机制尚不明确。有报道[15]证实FOXC1可通过激活MST1R/P13K/AKT通路促进恶性黑色素瘤细胞的增殖、分化、迁徙、浸润。FOXC1可作用于NF-κB信号通路，调控乳腺癌细胞的生物学行为[16]。近年来许多研究[17-18]发现上皮间质转化可能是肿瘤细胞发生转移侵袭的重要机制。在上皮间质转化过程中，上皮细胞逐渐丧失细胞极性，丢失细胞间的黏附连接和紧密连接，最终变成具有间质细胞形态和特征的细胞，从而获得浸润和游走迁移的能力[15]。高表达的FOXC1可诱导上皮间质转化，促进子宫内膜癌细胞及乳腺癌细胞的转移及侵袭[19-20]。或许，FOXC1也是通过促进上皮间质转化而增强了NSCLC细胞的转移侵袭能力，但有关机制仍待进一步研究。

综上，FOXC1在NSCLC组织中表达明显高于癌旁正常组织，且与肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM分期相关；FOXC1高表达组患者的PFS明显短于低表达组；因此，FOXC1表达高低可作为评估NSCLC患者预后的一个重要参考因素，明确FOXC1在NSCLC发生、发展过程中的作用机制可为临床治疗NSCLC提供新的靶点与思路。本研究的缺陷是纳入患者例数较少，且低表达组样本量只有14例，故研究结果需更大的样本量进一步验证。

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