盐酸伊伐布雷定对慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响

李美玲，张卫国，祝万洁

郑州大学第二附属医院心血管内科 郑州 450014

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是心血管疾病最主要的死因[1]。CHF最重要的病理学基础是心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)[2]，因此抑制MF可控制CHF患者心功能的进一步恶化。MF是指心脏基质内胶原纤维大量聚集、胶原含量增加或胶原成分发生变化[3]。心肌胶原纤维的表达调节涉及结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等多种物质，抑制CHF大鼠心肌组织中CTGF表达水平、增加心肌组织内SOD含量，可能减缓CHF大鼠MF的进程[4]。盐酸伊伐布雷定(ivabradine hydrochlorid，Iva)是第一个应用于临床的高度特异性超极化的内向离子流通道(If通道)的药物，主要用途是控制窦性心率[5]。研究[6]显示，Iva具有缩小心肌梗死面积、降低心肌耗氧量、延缓心力衰竭、改善心功能等作用，然而其对MF的影响尚不明确，为此，作者进行了如下研究。

1　材料与方法

1.1实验动物、主要药品、试剂和仪器44只健康Wistar大鼠，体重200～250 g，购自郑州大学实验动物中心。戊巴比妥钠购自北京化学试剂公司，Iva购自法国施维雅公司，RM-62000型四导电生理仪、SOD试剂盒购自日本同仁化学研究所，抗大鼠心肌组织CTGF多克隆抗体购自美国 Bio Vision公司，Western blot一抗、二抗稀释液、封闭液、蛋白显色试剂均购自Sigma公司。751G-可见紫外分光光度计(上海分析仪器厂)，高速匀浆机(上海弗鲁克流体机械仪器制造有限公司)，酶标记仪、电泳仪(美国 Bio-Rad公司)

1.2实验分组及处理采用随机数字表法将44只健康Wistar大鼠分为假手术组、模型组、Iva组、阳性对照药(倍他乐克)组。除假手术组外，其余3组大鼠均采用缩窄腹主动脉的方法构建CHF大鼠模型[7]：将戊巴比妥钠配制成30 g/L，腹腔注射麻醉大鼠，在肋弓处沿前正中线切开腹部皮肤，切口长约2.5 cm，打开腹腔，分离腹主动脉，平行于腹主动脉放置7号手术针并用0号丝线绕手术针结扎，取出手术针，确定腹主动脉畅通，最后关腹。假手术组只分离腹主动脉，但不结扎。大鼠手术后均连续3 d腹腔注射20万U青霉素G。术后第6周末测定大鼠心脏左室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)，LVEDP≥15 mmHg为建模成功的标准。处理组动物均建模成功，建模成功后Iva组每d灌胃10 mg/kg Iva，阳性对照组每d灌胃10 mg/kg倍他乐克；假手术组和模型组每d灌胃10 mg/kg生理盐水。第12周末，检测大鼠LVEDP、心肌组织内SOD含量及CTGF表达水平。

1.3检测项目及方法①大鼠经右颈总动脉逆行插入导管至左心室，经压力换能器输入RM-62000型四导电生理仪，记录LVEDP。②大鼠处死后取部分心肌组织，用40 g/L多聚甲醛固定，剩余心肌组织高速匀浆，按ELISA试剂盒方法检测心肌组织中SOD含量。③提取心肌组织中的总蛋白，用聚丙烯酰胺凝胶在220 V恒压下电泳分离CTGF蛋白，然后把CTGF蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上，用含脱脂奶粉的TBST液进行封闭，放在摇床上水平慢摇1 h，加入CTGF一抗(按11 000稀释)、β-actin一抗(按1400稀释)，在4 ℃下孵育过夜，第2天再用TBST液漂洗3遍后，加入二抗(按120 000稀释)在摇床上慢摇孵育1 h，最后DAB显影。用Image J软件分析蛋白显影图，用β-actin蛋白作对照，计算目的条带的相对灰值度。④分别用HE、masson两种染色方法观察心肌组织纤维化程度。

1.4统计学处理采用SPSS 17.0进行分析，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较各组大鼠LVEDP、心肌组织中CTGF表达水平和SOD含量，检验水准α=0.05。

2　结果

2.1各组鼠LVEDP、心肌组织中CTGF表达水平和SOD含量的比较见表1。假手术组相比，模型组大鼠LVEDP增大，心肌组织中SOD含量减少，CTGF表达水平升高。与模型组比较，Iva组大鼠LVEDP减小，心肌组织中SOD含量增加，CTGF表达水平降低(P<0.01)。

表1　各组大鼠LVEDP、心肌组织中CTGF表达水平和SOD含量的比较

1 mmHg=0.133 kPa；*：组间两两比较，P均<0.01

2.2各组大鼠心肌组织病理学观察结果见图1。HE染色显示，假手术组大鼠心肌细胞形态结构清楚，排列整齐；模型组大鼠心肌细胞心态结构不完整，细胞断裂、排列紊乱，炎性细胞增多，伴出血坏死；Iva组大鼠心肌细胞形态结构稍完整，排列稍齐，极少量炎细胞和少量出血坏死。Masson染色结果显示，假手术组未见胶原纤维沉积；模型组大鼠心肌细胞和血管周围可见大量蓝色的胶原纤维；Iva组有少量胶原纤维沉积。

A:假手术组;B:模型组;C:Iva组图1　大鼠心肌组织Masson染色结果(Masson染色，×200)

3　讨论

本实验采用缩窄腹主动脉导致容量负荷增加的方法制备CHF大鼠模型。临床上常用LVEDP表示心脏的容量负荷。LVEDP增加导致充血性心力衰竭，长期CHF可使心肌细胞发生纤维化。研究[8]显示，当CHF时，MF主要表现为胶原蛋白大量积聚，胶原蛋白含量增加。光镜下观察发现模型组大鼠心肌细胞形态结构被破坏，细胞断裂，排列紊乱，大量蓝色胶原纤维聚集，心肌细胞发生了纤维化。模型组大鼠心脏LVEDP比假手术组明显增大，再次验证CHF会造成LVEDP升高。LVEDP升高会导致心肌细胞内线粒体数目增加，ATP减少，胶原纤维合成增加，从而加速CHF大鼠MF的进展。另外，LVEDP升高增加了心肌细胞耗氧量，心肌细胞缺氧，促进CHF大鼠的MF。Iva组LVEDP减小，大鼠心肌细胞形态结构稍完整、排列稍齐、胶原纤维沉积减少，提示Iva对CHF大鼠MF产生抑制作用可能与降低CHF大鼠LVEDP有关。

SOD是生物体内重要的抗氧化酶，是生物体内清除自由基的首要物质，可通过测定SOD含量间接评价MF。发生CHF时，氧化应激反应增强，心肌细胞合成的抗氧化酶减少，无法清除心肌细胞内积聚的自由基，加剧CHF的MF。与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织中SOD含量减少，这一研究结果进一步证实了氧化应激参与了CHF的MF的过程。有文献[9-10]显示，Iva可以减少慢性CHF大鼠心肌细胞内炎症因子的合成，抑制氧化应激反应。本研究结果显示，Iva组大鼠心肌组织中SOD含量比模型组增加，表明Iva可能通过调节CHF大鼠心肌组织中SOD含量，从而对MF产生抑制作用。

CTGF因具有明显的丝裂原性和趋化性，能诱导成纤维细胞增殖，是发生MF的重要因子。免疫印迹结果显示，模型组CTGF蛋白表达水平较假手术组升高，提示CHF大鼠MF与心肌组织中CTGF表达有关。与模型组相比，Iva组心肌CTGF蛋白表达水平降低，推测Iva对CHF大鼠MF产生抑制作用可能与心肌组织中CTGF的表达下调有关。

综上所述，Iva可通过调节CHF大鼠LVEDP、心肌组织中SOD含量、心肌组织中CTGF表达水平，从而对CHF大鼠MF产生抑制作用。

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