转基因鲤鱼与对照鲤肠道微生物群落差异研究

饶刘瑜　李学梅　李星浩　朱文根　余育和　颜庆云

(1. 中国科学院水生生物研究所, 中国科学院水生生物多样性与保护重点实验室, 武汉 430072; 2. 中国科学院大学, 北京100049; 3. 中国水产学院长江水产研究所, 农业部淡水生物多样性保护重点实验室, 武汉 430223;4. 中山大学, 环境科学与工程学院, 广州 510275)

鱼类肠道中寄居着复杂多样的微生物菌群, 它们共同构成了一个重要的功能单元, 也被称为宿主特定的“器官”, 并与宿主相互依存、互利共生[1,2]。鱼类肠道中微生物菌群的形成过程十分复杂, 且在不同的生长发育阶段, 微生物组成和数量也有规律地进行演替, 也会因鱼类所生活的水环境以及摄食条件等不同而有所差异[3,4]。水体中残留的农药、抗生素, 以及养殖过程微生物制剂的使用等也可对鱼类肠道中的微生物菌群结构造成一定的影响[5,6]。此外, 由于种类、年龄、基因等因素的影响, 不同的鱼类肠道微生物组成也不同。目前已经证实, 宿主基因型是影响高等哺乳动物肠道微生物群落组成的重要因素之一[7,8], 而对于低等脊椎动物的研究较少。Ley等[9]通过研究小鼠发现, 亲子代之间、子代个体之间的盲肠微生物菌群组成结构相似, 而无血缘关系的小鼠在属水平上存在明显不同。Zoetendal等[10]通过比较不同人群粪便中微生物群落16S rRNA基因序列发现, 双胞胎肠道微生物的相似性远高于夫妻之间或完全不相关的2个个体。本研究以转“全鱼”生长激素基因鲤为研究对象, 采用454高通量测序对16S rRNA基因测序的方法分析其肠道微生物组成, 旨在探讨转“全鱼”生长激素基因鲤与对照鲤肠道微生物群落结构的组成差异, 为进一步研究转基因鱼生长代谢和抗病能力与肠道微生物之间的关系提供理论基础。

1　材料与方法

1.1　样品采集

实验所用转“全鱼”生长激素基因鲤和对照鲤养殖于中国科学院水生生物研究所鱼类基因工程学学科组官桥养殖基地。孵化3d后开始部分进食,但在一定程度上还依赖于自身的营养; 孵化6d后,卵黄囊消失并开始平游, 此时营养获取主要依赖于水体中的浮游生物。本研究从第6天开始肠道样品采集, 在所有样品采集前, 对其进行饥饿24h处理。由于此时的鱼个体小, 为确保肠道样品微生物的总DNA量, 将5条仔鱼的肠道混合在一起作为1个样品。之后分别采集2月龄(2 m)和5月龄(5 m)的幼鱼通过氧气袋打包带回实验室, 用于采集肠道内容物(1条幼鱼的肠道作为一个样品), 最后得到转基因鲤和对照鲤各3个样品。实验期间, 转基因鲤和对照鲤饲养于同一水源环境中, 投喂相同的人工饲料。试验期间水温23—30℃, 分别在每天9：00和15：00投喂。

1.2　肠道微生物群落总DNA提取

参照已有方法[11]收集肠道和肠道内容物。向每管样品加入1 mL裂解液, 再采用常规的酚/氯仿/异戊醇法进行抽提纯化总DNA。

1.3　PCR扩增及测序分析

将纯化后的基因组DNA作为PCR模板, 对微生物基因组16S rRNA V1-V3区进行扩增, 其序列分别为27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和533R (5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′), 同时在正向引物5' 端添加Barcode序列区分样品[12]。反应体系含： 5×FastPfu缓冲液 4.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2μL、正向引物(5 μmol/L) 0.4μL、反向引物(5 μmol/L) 0.4μL、FastPfu聚合酶 0.4μL、模板DNA 10 ng, 补ddH2O至 20μL。PCR反应是在S1000TM热循环仪上(Bio-Rad, 美国)进行, 反应条件为： 95℃预变性 2min, 95℃变性30s, 55℃退火30s,72℃延伸30s, 25个循环后, 72℃延伸5min。PCR产物用1.5%的5μL琼脂糖凝胶100V稳压电泳以检测PCR扩增效果, 扩增后得到的产物用QIAquick凝胶回收试剂盒(Qiagen, 美国)纯化回收, 然后每个样品取200 ng等量混合后在美吉生物有限公司(上海)GS FLX (454 Life Sciences/Roche Applied Science)高通量测序平台进行测序[13,14]。

1.4　数据分析

在454测序完成后, 使用Mothur (www.mothur.org)生物信息学软件包在97%序列相似性下, 以最远邻近算法对454测序序列进行聚类划分分类单元(Operational taxonomic unit, OTU), 应用Ribosomal Database Project (RDP, http：//rdp.cme.msu.edu/)在线分析工具对454测序数据进行微生物种类划分。通过SPSS软件对比实验组和对照组的Alpha-多样性,用EXCEL 2010软件对OTU种类的丰度进行分析,筛选出相对丰度大于0.1%的OTU的优势菌, DCA分析则用来比较不同发育时期两种鱼肠道微生物群落结构的差异。

2　结果

2.1　转基因鲤和对照鲤肠道微生物差异性比较

对转基因鲤和对照鲤进行除趋势对应分析(Detrended correspondence analysis, DCA)并构建图(图 1)。从图中可以看出, 6日龄及5月龄的样点靠的比较近, 说明在两组样品的肠道微生物群落结构差异相对较小。而2月龄的转基因鲤与对照鲤的点相距很远, 表明在2月龄的转基因鲤与对照鲤肠道菌群存在一定差异。

进一步比较转基因鲤和对照鲤的肠道微生物的α-多样性, 并构建箱线图(图 2)。 从图中可以看出, 处理组样品的Shannon多样性指数、pielou.evenness指数和inverse.Simpson指数、Shannon.evenness指数均大于对照组, 表明转基因鲤的肠道微生物α-多样性要比对照组鲤高。

2.2　转基因鲤和对照鲤肠道微生物组成

将454测序获得的序列经RDP数据库比对分析发现, 6个肠道样本内微生物OTUs分属17个门, 包括放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)等。总体来看, 相比对照鲤, 转基因鲤肠道内梭杆菌门(Fusobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)的丰度增加, 而变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)的丰度减少。

图 1　转基因鲤和对照鲤肠道微生物差异性分析Fig. 1　Difference analysis of gastrointestinal microbiota in transgenic common carp and controls

图 2　转基因鲤与对照鲤肠道微生物α-多样性比较Fig. 2　Alpha-diversity of gastrointestinal microbiota in transgenic common carp and controls

变形菌门在转基因鲤和对照鲤肠道样品中均为优势菌门, 变形菌门在转基因鲤肠道菌群中所占比例32.46%—53.85%; 其次为梭杆菌门和放线菌门, 分别占转基因鲤肠道总细菌的7.78%—28.36%和13.93%—22.14%; 另外, 拟杆菌门占的比例为5.6%—17.91%, 厚壁菌门占2.72%—14.93%。变形菌门在对照鲤肠道菌群中所占比例为29.98%—53.98%; 而梭杆菌门、放线菌门和厚壁菌门, 分别占对照鲤肠道总细菌的1.99%—21.27%、16.67%—26.87%和1.37%—11.82%; 另外, 拟杆菌门所占的比例为12.31%—13.56%, 其他的不常见细菌门所占比例相对较少。

厚壁菌门(Firmicutes)主要存在于转基因鲤肠道中, 而对照鲤中拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度较高。且随着鲤肠道的发育, 转基因鲤和对照鲤肠道内变形菌门的丰度呈现下降趋势。针对不同发育时期的转基因鲤和对照鲤进行分析, 2种鱼在6日龄时, 主要优势菌门(Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Fusobacteria)在两种鱼肠道菌群中所占比例相似, 但随着发育, 在2月龄和5月龄时表现出差异(图 3), 且2月龄时两者差异更为明显。

有研究表明拟杆菌门和厚壁菌门的比例在人类当中一直被认为与宿主的肥胖存在密切关系[18]。对不同发育阶段转基因鲤和对照鲤肠道内这两种菌的比值进行比较, 结果显示两种鱼之间不存在显著差异性(One-way ANOVA： F=0.554, P＞0.05)。但从表 1可以观察到, 转基因鲤各发育阶段, 除6日龄外, 2月龄和5月龄中厚壁菌门所占比例均大于拟杆菌门; 而对照鲤在3个发育阶段中厚壁菌门比例均低于拟杆菌门, 特别对比在2月龄时肠道微生物Bacteroidetes/Firmicutes的比例, 转基因鲤(0.392)明显小于对照鲤(8.978)。

图 3　转基因鲤(T)和对照鲤(C)肠道菌群的主要门Fig. 3　Major bacterial phylum in the intestine of transgenic common carp (T) and controls (C)

进一步在属水平的分析发现, 6日龄鲤肠道内,转基因鲤和对照鲤内存在共有优势菌(相对丰度大于0.1%)16种, 转基因鲤存在6种特有优势菌, 而对照鲤存在2种特有优势菌; 2月龄鲤肠道内, 存在共有7种优势菌, 转基因鲤10种特有优势菌, 对照鲤11种特有优势菌; 5月龄鲤肠道内, 存在共有14种优势菌, 转基因鲤4种特有优势菌, 对照鲤6种特有优势菌。其中2月龄转基因鲤和对照鲤肠道微生物的共有优势菌种类最少, 而特有优势菌种类最多, 说明在3个发育时期中, 2月龄转基因鲤和对照鲤肠道微生物组成结构差异最大。

表 1　拟杆菌门和厚壁菌门细菌在转基因鲤(T)和对照鲤(C)肠道中相对丰度比较Tab. 1　The relative ambulance of Bacteroidetes and Firmicutes between transgenic common carp (T) and controls (C)

分别对转基因鲤和对照鲤在3个发育阶段各自特有的优势菌属(丰度大于0.1%)进行分析发现, 6日龄转基因鲤有18种特有优势菌, 而同期的对照鲤只有9种; 2月龄转基因鲤19种, 对照鲤33种; 5月龄转基因鲤5种, 对照鲤只有1种特有优势菌(图 4)。

同时还发现在发育过程中, 在2月龄时, 两种鱼的微生物类群特有OTU数最多, 而共有OTU数最少, 且转基因鲤肠道微生物OTU数(108)大于对照鲤(93), 而在6日龄和5月龄中两者数值相似, 说明2月龄两种鱼肠道微生物种类存在差异(图 5)。

3　讨论

鱼类肠道微生物可分泌多种消化酶(如蛋白酶、纤维素酶等)以参与宿主营养物质代谢, 微生物还能调节鱼类机体免疫, 因此对促进鱼类生长发育、维持宿主健康等均具有非常重要的作用[19—21]。已有研究表明, 肠道微生物群落结构主要由宿主自身(如遗传背景、发育阶段、健康状况、饮食条件等)及外界环境因素等所决定[22,23]。不同物种之间肠道微生物细菌群落结构不同, 但在同一物种的特定发育阶段能保持相对稳定[24—26]。Stevens和Devlin[27]指出, 食欲过剩以及生长激素基因可直接或间接引起肠道几乎所有形态的改变, 其中生长激素基因对肠道组织产生了直接影响, 主要是使鱼类发生短期肠道形态学的变化, 以应对短期需求的变化。

3.1　肠道微生物群落组成分析

本研究旨在探讨同一生长环境下, 转入外源生长激素基因的转基因鲤肠道微生物群落与对照鲤肠道微生物的群落结构差异。与哺乳动物相似, 水生动物的遗传背景与环境条件、食性差异、发育阶段等都是影响肠道微生物群落结构的主要因素。本研究通过对6日龄、2月龄和5月龄转“全鱼”生长激素基因鲤(Cyprinus carpio L.)与对照鲤肠道菌群的分析, 发现2月龄鱼肠道微生物组成在转基因鲤和对照鲤之间存在差异, 而其他两个时期间的差异不明显。主要可能是在2月龄鱼肠道的分化可能使其产生了发育差异, 因为在该时期转基因鲤表现出比对照鲤明显快的生长速度, 各自形成了不同的内环境, 从而形成了不同的消化道微生物群落[11]。

图 4　转基因鲤(T)和对照鲤(C)肠道优势菌属(＞ 0.1%)Fig. 4　Dominant bacterial genus (＞ 0.1%) of the intestinal microbes in transgenic common carp (T) and controls (C)

图 5　转基因鲤(T)和对照鲤(C)肠道微生物OTU数维恩图Fig. 5　Venn diagram showing the common and specific OTUs in transgenic common carp (T) and controls (C)

3.2　肠道微生物门水平和属水平差异

对各发育时期肠道微生物在门水平上的丰度进行分析发现, 在6日龄时两种鱼肠道内主要优势菌群中所占比例相似, 而2月和5月龄差异较大。可能是因为转基因鲤和对照鲤在6日龄时刚刚开口不久, 卵黄囊未完全吸收, 且又处于同一环境, 此时肠道微生物群落结构刚刚开始形成, 故它们的肠道优势微生物种类和丰度均相似。而随着卵黄囊被吸收完, 转基因鲤和对照鲤开始完全依赖于外源性食物, 2月龄和5月龄时肠道微生物组成差异显著, 说明随着2种鱼肠道发育可能分别建立了不同的肠道微生物群落。

近年来肠道微生物和肥胖的关系受到了广泛关注, 研究发现肥胖主要与人类肠道中拟杆菌门和厚壁菌门微生物的丰度变化有关[28], 但在鱼类肠道微生物研究中是否也存在, 有待进一步研究。Turnbaugh等[29]研究发现, 与正常个体比较, 肥胖个体肠道微生物中Firmicutes比例较高, 而Bacteroidetes比例较低; 当肥胖个体减肥成功时, 其肠道微生物中Firmicutes比例则与正常个体变得较为相似。通过进一步比较, 随着鲤的发育, 转基因鲤和对照鲤肠道内比例最高的优势菌门Proteobacteria丰度均呈现明显下降趋势, 且厚壁菌门主要存在于转基因鲤肠道中, 而对照鲤中拟杆菌门较多, 说明了转生长激素基因的表达, 可能引起了转基因鲤肠道内微生物群落的改变, 导致了厚壁菌增多, 而拟杆菌减少。在2月龄时转基因鲤肠道微生物中的Bacteroidetes/ Firmicutes比例明显小于对照鲤, 从而促进了转基因鲤的快速生长, 这与Li等[11]基于荧光定量PCR的结果是吻合的。

相对两种鱼在6日龄和5月龄的肠道微生物对比分析, 在属水平2月龄转基因鲤和对照鲤肠道微生物共有优势菌种类最少, 而特有优势菌种类最多,而且在该发育时期转基因鲤各菌群的丰度均发生了变化。

3.3　展望

有研究发现小鼠高密度脂蛋白基因的突变也会引起其肠道微生物群落组成的改变, 但宿主基因对微生物的影响并非直接, 而是间接通过机体新陈代谢起作用[30,31]。范新浩等[32]利用高通量测序技术比较了3月龄转入内源性lncRNA-GTL2 的转基因小鼠和正常小鼠的肠道微生物, 结果显示小鼠肠道微生物的群落结构和构成总体上虽没有显著差异, 但存在一定的个体差异。

基于转基因鲤机体躯干和背部肌肉发达, 生长速度快, 体长、全长显著大于对照鲤等特征[33], 可以推断宿主基因型变化可能影响了宿主鱼类的物质代谢进而导致其表型的改变。本研究结果表明,2月龄转基因鲤的肠道微生物组成与对照鲤相比发生了改变, 而这些改变是否因转“全鱼”生长激素基因引起尚有待研究。下一步可针对2月龄转基因鲤各方面的生理特征以及宿主代谢机制进行研究, 确定外源激素表达与肠道微生物结构、食物转化率、生长速率等之间的关系, 为进一步揭示转基因鲤快速生长效应的微生物学调控机理奠定基础。

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