三疣梭子蟹PtToll-1受体的原核表达及组织、细胞分布研究

张丹枫　王国良　杨　宁,　张　鑫　周素明　刘　顺

(1. 宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室, 宁波 315211; 2. 青岛农业大学海洋科学与工程学院, 青岛 266109)

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)隶属甲壳纲(Crustacea), 十足目(Decapoda), 梭子蟹科(Portunidae), 梭子蟹属(Portunus), 俗称白蟹、枪蟹等,广泛分布于中国、朝鲜、日本及马来西亚群岛等海域, 在我国是一种主要的海产经济蟹类[1]。因其养殖产量较高, 肉质鲜美, 营养丰富, 经济效益高,现已成为我国东部沿海地区重要的养殖品种。近年来, 随着养殖规模的不断扩大和养殖集约化程度的不断提高, 其病害日趋严重, 特别是由细菌、真菌、病毒和寄生虫等引起的疾病频频暴发, 严重影响三疣梭子蟹养殖产业的可持续健康发展[2—5]。三疣梭子蟹是低等的海洋无脊椎动物, 缺乏后天免疫系统, 主要依赖其先天性免疫系统来抵御病原微生物的入侵[6]。深入研究三疣梭子蟹的先天性免疫防御机制, 并探讨提高三疣梭子蟹抗病力的有效途径和方法, 有助于保持三疣梭子蟹养殖产业的健康可持续发展[7]。

Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)是一类介导识别病原相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns, PAMP)的膜受体[8], 在机体抗感染等天然免疫过程中发挥重要作用[9]。20世纪90年代, 研究者首次在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中发现Toll受体的存在[10,11], 随后在人、小鼠、哺乳动物、鱼类、软体动物及其他节肢动物等中也发现大量的Toll样受体[12]。目前在黑腹果蝇中发现存在9种不同类型的Toll受体1—9, 然而其中只有Toll-1介导经典的Toll-MyD88信号通路, 也称之为抗菌肽通路[13,14]。在甲壳动物中, 国内外学者相继从中国明对虾[15](Fenneropenaeus chinensis)、凡纳滨对虾[16—18](Litopenaeus vannamei)、日本对虾[19](Penaeus japonicus)、拟穴青蟹[20](Scylla Paramamosain)和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)中克隆出Toll受体相关分子[21]。本实验室从三疣梭子蟹中已经克隆出3种不同Toll受体分子PtToll1-3[22], 生物信息学及蛋白同源性比对发现只有PtToll-1同果蝇的Toll-1无论在蛋白结构还是在进化关系上均比较接近, 由此推测三疣梭子蟹的PtToll-1受体可能对三疣梭子蟹的抗菌肽的表达具有调控作用, 因此对PtToll-1展开相关研究。

本实验在课题组前期研究基础之上, 对三疣梭子蟹Toll-1受体进行原核表达、蛋白纯化及制备相应的抗血清, 还利用组织免疫荧光技术首次在蛋白水平上研究PtToll-1在消化道、肝胰腺、鳃、心脏及肌肉组织中的分布, 并且通过细胞免疫组化和免疫荧光首次在血细胞中进行PtToll-1的分布定位,同时进行体外真核表达在HEK-293T细胞中的定位,以期为深入探讨三疣梭子蟹PtToll-1受体蛋白的生理及免疫学功能的研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1　实验材料

实验用三疣梭子蟹(大约150 g)购于宁波市路林市场, 健康活力好。实验用小鼠购置浙江省实验动物中心。实验用HEK-293T细胞株、大肠杆菌菌株以及原核表达载体、实验试剂均购置宁波航景生物公司。

1.2　实验方法

三疣梭子蟹Toll-1受体胞外结构域原核表达载体的构建对三疣梭子蟹Toll-1受体的全基因进行生物信息学分析, 并且对PtToll-1蛋白的一级结构进行预测。基于分析预测结果, 应用Primer 6.0软件设计特异性引物, 用于PtToll-1受体胞外结构域片段的亚克隆。该区域不包括信号肽部分、跨膜区以及细胞内的信号传导区。亚克隆引物以及测序引物详见表1。引物由生工生物工程有限公司(上海)合成。

取健康三疣梭子蟹的血细胞, 提取RNA进行反转录获得第一链cDNA, 以此为模板进行PCR反应来扩增PtToll-1受体胞外结构域。反应体系为50 μL,PCR反应条件为98℃变性10s, 55℃退火15s, 72℃延伸30s, 反应30个循环。PCR产物经纯化及加A尾后直接连接至pEASY®-E1 Expression Vector上。将构建好的表达载体转化至Trans1-T1感受态细胞中, 用T7 Promoter Primer和PtToll-1-R扩增并测序鉴定阳性克隆为pEASY-E1-PtToll-1。

PtToll-1胞外结构域的诱导表达将转入pEASY-E1-PtToll-1的菌液接种于含有氨苄LB液体培养基中, 用终浓度为0.3 mmol/L的IPTG分别诱导1h、3h及5h。诱导表达结束后, 离心收集菌体并加入PBS重悬, 超声破碎细胞。离心后上清与沉淀分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳, 检测目的蛋白的表达情况。

抗PtToll-1多克隆抗体制备将乳化好的蛋白抗原对小鼠进行免疫, 首次免疫剂量为100 μg/只,次免2次, 每次剂量为50 μg/只, 免疫间隔时间为7d。最后一次免疫后5d摘除免疫小鼠眼球进行取血, 血液置于4℃冰箱过夜, 2000×g, 4℃离心10min分离血清, 免疫血清分装后于-80℃保存备用。

Western Blot将SDS-PAGE后的蛋白胶电转至NC膜上, 用5%的脱脂奶粉室温孵育封闭1h,TBST漂洗印迹膜1遍。加入多克隆抗体一抗(1∶1000), 室温孵育1h, 后室温下漂洗3次。加入稀释好的商品化二抗(1∶2000), 室温下孵育1h后室温下漂洗3次。将漂洗好的印迹膜浸入到BCIP/NBT碱性磷酸酶显色液中, 室温避光孵育10min。同时做非免疫血清阴性对照。显色完毕将膜浸入水中, 终止反应。Bio-Rad凝胶成像仪拍照。

免疫组化取适量血淋巴细胞均匀涂在多聚赖氨酸处理过的载玻片上, 自然干燥固定, 用3%H2O2室温处理5—10min以灭活内源性酶, 蒸馏水洗3次。滴加正常山羊血清封闭液室温封闭20min后滴加适当稀释的一抗(1∶100), 37℃孵育1h, PBS洗3次后滴加生物素化的兔抗小鼠IgG, 37℃孵育20min, 漂洗3次后滴加试剂SABC-AP, 37℃孵育20min, 漂洗3次; 将BCIP/NBT显色试剂混匀后加至玻片, 37℃显色10—30min, 水洗后核固红轻度复染, 水洗, 干燥后水溶性封片剂封片, 显微镜下观察拍照。阴性对照一抗为非免疫小鼠血清。

表1　胞外区扩增引物及通用引物序列Tab. 1　Primers for amplification and sequencing

间接免疫荧光组织免疫荧光： 分别取三疣梭子蟹的消化道、肝胰腺、鳃、心脏和肌肉组织,4%多聚甲醛固定24h, 梯度乙醇脱水, 二甲苯透明,石蜡包埋、切片。将白片放入烘干后经过二甲苯脱蜡, 乙醇复水, 柠檬酸抗原修复后, 用5% BSA室温封闭30min,, 滴加适量一抗4℃孵育过夜, PBS洗涤3次; 加入FITC标记的羊抗小鼠IgG, 37℃孵育30min, PBS洗涤3次, 抗荧光淬灭封存液封片, 荧光显微镜下观察拍照。阴性对照一抗为非免疫小鼠血清。

细胞免疫荧光： 将血淋巴细胞涂于载玻片上,晾干后用4%多聚甲醛固定30min, 3% H2O2室温处理10min, 5% BSA室温封闭30min, 甩去封闭液, 滴加适量一抗37℃孵育1h, PBS洗3次/10min; 滴加FITC标记的羊抗小鼠IgG, 37℃孵育30min, PBS洗3次后滴加抗荧光淬灭封存液封片后于荧光显微镜下观察拍照。阴性对照一抗为非免疫小鼠血清。

真核表达载体的构建应用Primer 6.0 软件设计携带有双酶切位点(5′ Xho I以及3′ Kpn I)的引物, 引物序列见表1。以反转录合成的cDNA为模板来扩增具有双酶切位点的PtToll-1受体胞外结构域。扩增反应体系为50 μL, PCR反应条件为98℃变性10s, 55℃退火15s, 72℃延伸30s, 反应30个循环。

PCR扩增产物经纯化以及加A尾反应后连接至pMD-18T载体。将构建好的表达载体转化至DH5α感受态细胞中, 用引物M13F和PtToll-1-RM鉴定阳性克隆。阳性克隆菌液经过测序无误后抽提质粒。对上述质粒以及商品化载体pEGFP-N2(Invitrogen)同时进行双酶切。酶切产物割胶纯化后用T4连接酶于16℃过夜连接。将构建好的真核表达载体转化至Top10感受态细胞中, 卡那霉素筛选, 经过PCR验证正确后抽提质粒pEGFP-N2-PtToll-1。

细胞转染及观察HEK293T细胞铺在φ14mm细胞爬片中培养24h后利用商品化脂质体Lip2000将构建好的pEGFP-N2-PtToll-1转染至细胞内, 同时空载体pEGFP-N2同时转染细胞作为对照。细胞转染12—18h后, 加500 μL免疫染色固定液(Beyotime)固定细胞10min, 然后每孔加500 μL含有0.1% TritonX-100 PBS缓冲液透膜10min, 经过PBS洗涤后加500 μL DAPI染核3—5min, 1% BSA的PBS溶液洗涤3次, 吸尽液体, 往载玻片上滴加1滴抗荧光淬灭封片液, 取出细胞爬片, 经双光子激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞定位并拍照。

2　结果

2.1　rPtToll-1蛋白的表达及抗血清特异性检测

构建正确的载体pEASY-E1-PtToll-1菌液经IPTG诱导不同时间后的表达产物进行SDS-PAGE电泳, 结果表明： 标签目的蛋白主要以包涵体蛋白的形式存在于沉淀中, 而上清中不含有标签目的蛋白, 经IPTG诱导5h后表达量最高, 且该蛋白分子量约为87.18 kD (图1a)。

将免疫小鼠获得的抗血清, 经Western Blot检测, 结果如图1b所示, 与对照组非免疫血清(图1c)比较, 在70—100 kD可见单一条带, 说明免疫小鼠获得的抗血清与目的蛋白之间特异性识别, 且制备的抗血清质量较高。

2.2　PtToll-1在三疣梭子蟹不同组织中的分布

免疫荧光染色结果显示, 在三疣梭子蟹消化道、肝胰腺、鳃、心脏、肌肉组织中均观察到绿色荧光, 即Toll-1受体在各组织中均有分布。但不同组织中Toll-1受体的分布不同, 具体如下：

三疣梭子蟹消化道免疫荧光染色结果显示阳性信号较强, 且主要位于消化道黏膜上皮基底部(图2A)。肝胰腺由肝小管组成, 肝小管由基膜及单层柱状细胞构成。荧光染色结果显示, 阳性信号很弱, 主要位于肝小管上皮(图2C)。鳃叶由鳃丝和鳃小片构成, 免疫荧光结果显示, 鳃丝上皮细胞和其间结缔组织及鳃小片上皮均有较强的阳性信号(图2E)。心脏有外层结缔组织和内层肌肉层组成, 免疫荧光结果显示, 内层肌肉层具有弱的阳性信号,而外层结缔组织层未见阳性信号(图2G)。步足肌为横纹肌, 免疫荧光结果显示, 肌纤维阳性信号较弱, 且仅分布在肌膜上(图2I)。

2.3　PtToll-1在三疣梭子蟹血细胞中的分布及定位

三疣梭子蟹血细胞免疫组化结果如图3所示,与对照血清处理细胞相比, PtToll-1抗血清处理过的细胞表面具有较强阳性信号, 该结果说明PtToll-1在血细胞表面表达, 进一步从蛋白水平证实了PtToll-1在三疣梭子蟹血细胞的分布。另外, PtToll-1在颗粒细胞中表达较为强烈, 而在透明细胞中表达相对较弱, 该结果显示PtToll-1在不同血细胞中的分布是不均匀的, 这极有可能与不同类型血细胞的功能不同相关。

三疣梭子蟹血细胞主要由透明细胞和颗粒细胞组成, 免疫荧光结果显示, 各种类型的血细胞中均有阳性信号, 而细胞核中未见阳性反应。即Toll-1受体主要位于细胞膜上和细胞质中(图4)。

图1　PtToll-1胞外结构域重组蛋白SDS-PAGE分析及蛋白免疫印迹检测结果Fig. 1　SDS-PAGE analysis of PtToll-1 Protein and the result of Western Blotting

图2　PtToll-1在消化道、肝胰腺、鳃、心脏及肌肉组织中的分布Fig. 2　The distribution of PtToll-1 in the digestive tract,hepatopancreas, gill, heart and muscle

图3　PtToll-1三疣梭子蟹血细胞免疫组化结果(标尺, 25 μm)Fig. 3　PtToll-1 expression in the hemocytes of the crab examined by immunohistochemistry (Scale bar, 25 μm)

2.4　PtToll-1在HEK-293T细胞中的定位

成功构建的PtToll-1真核表达载体, 经过转染HEK-293T细胞并成功表达(图5)。PtToll-GFP融合蛋白主要分布在HEK-293T膜上, 但细胞质中也有少量分布; 而pEGFP-N2转染的细胞可见绿色荧光信号在细胞中均分布且没有表达特异性(图5)。

3　讨论

三疣梭子蟹Toll受体与其他动物TLRs一致同属于Ⅰ型跨膜蛋白, 由于其蛋白序列较长, 其完整蛋白结构因具有跨膜区而具有一定的疏水性, 所以难以进行完整蛋白的原核表达。因此, 作者选择PtToll-1蛋白的胞外区进行体外原核重组表达及后续研究。本研究构建PtToll-1蛋白胞外结构域原核表达载体, 经IPTG诱导成功在大肠杆菌中高效表达出目的蛋白。SDS-PAGE结果显示rPtToll-1蛋白的分子量为87.18 kD, 与预期蛋白分子量一致。另外,结果还显示rPtToll-1蛋白以包涵体的形式存在于大肠杆菌菌体的不可溶成分中。蛋白经过尿素溶解、镍柱纯化及脱盐处理后与弗氏佐剂充分乳化后免疫小鼠获得特异性抗rPtToll-1蛋白的抗血清,为进一步开展PtToll-1蛋白的研究奠定基础。

图4　PtToll-1在血淋巴细胞中的分布(标尺, 25 μm)Fig. 4　The distribution of PtToll-1 in haemocytes (Scale bar, 25 μm)

图5　PtToll-1在HEK-293T细胞株中的定位(标尺, 20 μm)Fig. 5　Subcellular localizations of PtToll-1 in HEK-293T cells (Scale bar, 20 μm)

Toll样受体家族在分子结构上具有较高的相似性, 通常包含有一个负责识别配体的串联富含亮氨酸结构基序的胞外区, 一个跨膜结构以及一个比较保守的负责募集下游信号分子蛋白TIR结构域[23]。根据TLRs在不同细胞中表达特性则可将其分为3类包括广泛性表达： 如TLR1广泛存在于各类血细胞、淋巴细胞、上皮细胞及其胞器等; 局限性表达： 如TLR2和TLR5主要定位于髓源性细胞膜表面;特异性表达： 如TLR3主要定位于树突状细胞和自然杀伤细胞[24—26]。然而目前有关低等无脊椎包括甲壳类动物组织分布情况仅停留在mRNA水平上,在蛋白水平的研究极少。前期利用实时荧光定量方法在mRNA水平上研究了PtToll-1在不同组织的分布情况, 结果表明, PtToll-1在血淋巴细胞及鳃中表达量最高, 而在肌肉中表达量最低[22]。本研究利用组织免疫荧光技术在蛋白水平上对PtToll-1在不同组织的分布进行研究, 结果表明, PtToll-1在不同组织中均有分布, 但在不同组织中的分布情况不同。PtToll-1蛋白在鳃中分布最多, 其主要分布在鳃丝上皮细胞和其间结缔组织及鳃小片上皮; 其次在消化道膜上皮基底部, 而在肝胰腺和步足肌中分布相对较少。该结果与mRNA水平研究结果基本保持一致。

血淋巴细胞是甲壳动物重要的免疫细胞, PtToll-1在血淋巴细胞的高水平表达提示了其极有可能参与梭子蟹的先天性免疫过程。哺乳动物的研究表明TLRs家族各成员在细胞中位置不同其功能也不同： 定位于细胞膜上TLRs如Toll1、Toll2、Toll4、Toll5及Toll6主要参与识别细菌的脂多糖、脂蛋白及鞭毛等病原相关模式分子; 分布于各细胞器膜TLRs如Toll3、Toll7、Toll8及Toll9主要识别侵入细胞内的病毒及细菌的核酸[27]。本研究以三疣梭子蟹的血淋巴细胞作为研究模型, 利用免疫荧光及免疫组化技术对PtToll-1在血淋巴细胞中的定位进行探讨。研究结果发现, 2种方法均在血淋巴的细胞膜上检测到PtToll-1的表达。除此之外, 作者还构建了三疣梭子蟹Toll-1受体胞外结构域蛋白的真核表达载体pEGFP-N2-PtToll-1。通过激光共聚焦显微技术发现转染pEGFP-N2-PtToll-1重组质粒的细胞其细胞膜和细胞质上具有绿色荧光信号, 而对照空质粒则在整个细胞均有绿色荧光, 该结果说明pEGFP-PtToll-1蛋白在HEK293细胞膜上是表达的。该结果也验证了PtToll-1在血淋巴细胞定位的结果。

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