鹿茸多肽介导心肌干细胞分化对终末心肌分化基因ANP和MLC-2v表达的影响

黄晓巍，徐　岩，韩　冬，林　贺，律广富，李晓华，曲晓波，张　冰

(1.长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心药理实验室，吉林 长春130117；2.长春中医药大学药学院临床药学与中药药理教研室，吉林 长春130117；3.北京中医药大学中药学院临床中药系，北京 100102)

心肌细胞损伤是冠心病等各类心脏疾病的病理基础，但心肌细胞的再生能力较弱，一旦心肌受损，很难在短时间内自行恢复心肌功能。通过干细胞分化再生心肌细胞，实现心肌损伤的修复是心脏功能恢复的重要途径。心肌组织中存在成体心肌干细胞(cardiac stem cells，CSC)，CSC是目前最有希望修复心肌损伤的干细胞类型[1-2]。目前CSC的移植存在许多问题，临床应用受限，动员自体CSC，诱导其向心肌细胞分化改善心功能是比较可行的方案，许多中药有效成分具有干细胞诱导剂的作用，且具有不良反应少的特点[3-5]。鹿茸味甘、咸，性温补阳，归肝、肾经，禀纯阳之质，含生发之气，具有壮元阳、益精血、温通心阳、滋补肾精之功效，是中医临床采用温通心阳法治疗冠心病的核心药材之一[6-7]。鹿茸多肽是鹿茸的有效成分，有明显促进细胞再生作用。本研究通过体外细胞实验观察鹿茸多肽介导CSC分化对终末心肌分化基因心房钠尿肽(atrial natriuretic polypeptide，ANP)和心肌肌凝蛋白轻链2(myosin light chain 2v，MLC-2v)表达的影响，并探讨其作用机制。

1　材料与方法

1.1实验动物清洁级新生Wistar大鼠，雄性，由吉林大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(吉)2013-0001。

1.2药品、主要试剂和仪器鹿茸多肽(长春中医药大学药学院自制，批号：20150417，纯度>97%)，5-氮胞苷(中国上海阿拉丁试剂有限公司，批号：B1412007，纯度>98%)。胰蛋白酶(美国Sigma公司，批号：T0303)，胶原酶(北京索莱宝公司，批号：C8140)，DMEM和胎牛血清(美国Gibco公司，批号：12491-015、1009-141)，CEM培养基(自制，DMEM 180 mL、胎牛血清20 mL、L-谷氨酰胺2.58 mg、β-巯基乙醇1.4 μL)，琼脂糖和DNA上样缓冲液(上海碧云天公司，货号：ST004L、D0071)，AxyPrep总RNA小量制备试剂盒(美国Axygen公司，货号：AP-UN-MS-RNA-50)，DMA Ladder、ANP Elisa kit和MLC-2v Elisa kit(上海生工生物工程有限公司，货号：B600109、D730358、D710117)，PrimeScriptTMRT Master Mix和SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ(大连宝生物工程有限公司，货号：RR036A、RR82LR)。CO2孵箱(日本三洋公司，型号：MCO-17)，倒置显微镜(日本Olympus公司，型号：IX71)，低温离心机(德国Heraeus公司，型号：Biofuge primp R)，荧光定量PCR仪(美国Stratagene公司，型号：Mx3000)，凝胶成像系统(美国 Aplegen公司，型号：Omegalum C)；流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司，型号：Gallios)。

1.3 大鼠CSC分离提取和原代培养取刚出生2 d的健康Wistar大鼠的心脏于培养皿内，去除结缔组织并挤压出多余的血液，用PBS多次漂洗干净后，转移至无菌玻璃瓶中，将其剪成大小约为1 mm×1 mm×1 mm的块状物，反复吹打组织块弃去上清液，并用PBS清洗心脏组织至澄清，吸出PBS。加入0.25%胰蛋白酶(含0.20% EDAT)1 mL，消化5 min，吸弃上清液，再加入0.1%胶原酶1 mL，消化5 min；消化步骤重复3次。将消化好的心脏组织块，静置1 min，吸取上清液至1.5 mL离心管内，800 r·min-1离心2 min。吸去上清液，加入CEM培养基1 mL，反复轻轻吹打，将细胞悬液转移至细胞培养瓶内，置于37℃、5% CO2培养箱中孵育。

1.4大鼠CSC的传代培养取生长状态良好的CSC，弃去培养液，加入0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)1～2 mL，放置37℃、5% CO2培养箱内2～3 min，镜检细胞形态由梭形变为圆形，贴壁松弛，立即加入等量的细胞培养液终止消化作用，用移液器吹打培养瓶底，以致心肌细胞脱离瓶壁，将细胞悬液转移至1.5 mL离心管，800 r·min-1离心5 min，弃去上清液，加入细胞培养液，吹打成细胞悬液，转入新的细胞培养瓶中，放置在37℃、5% CO2培养箱内进行培养。

1.5c-Kit细胞免疫荧光鉴定分析取传代培养状态良好、呈对数生长的CSC，PBS漂洗后，经0.05%胰蛋白酶消化后，将细胞悬液接种于24孔板中，细胞密度为1×105cm-2。置37℃、5% CO2培养箱中培养48 h后，PBS漂洗3次，加入4%多聚甲醛300 μL，室温固定20 min，PBS漂洗3次；加入山羊血清(封闭液)200 μL，室温孵育60 min，PBS漂洗3次；加入一抗200 μL，4℃孵育过夜；PBS漂洗3次，加入二抗200 μL，37℃避光孵育60 min；PBS漂洗3次，加入200 μL Hoechst33342浸染5～10 min，弃去。荧光倒置显微镜检测荧光表达并拍照。采用流式细胞术检测CSC特异性表面标志物c-Kit和CD34的表达，以c-Kit阳性细胞表达占全部细胞百分比表示心肌干细胞纯度。

1.6CSC分组和药物诱导分化将传代培养状态良好、呈对数生长的CSC经胰酶消化，制成细胞密度为1×108L-1的单细胞悬液，分成12个培养瓶培养。药物诱导细胞共分4组：空白对照组(加等量缓冲液)、5-氮胞苷(终浓度3 μmol·L-1)、鹿茸多肽组(终浓度800 mg·L-1)和联合组(3 μmol·L-15-aza+800 mg·L-1鹿茸多肽)，各组待80%细胞贴壁后，加入相应药物诱导，37℃、5%CO2培养箱中培养48 h。

1.7ELISA法检测各组细胞上清液中MLC-2v和ANP表达水平收集各组细胞上清液，按上海生工生物工程有限公司提供的ANP和MLC-2v Elisa kit说明书检测各组细胞上清液中ANP和MLC-2v的表达水平，测定450 nm波长处吸光度(A)值。

1.8RT-PCR法检测各组细胞中ANP和MLC-2v mRNA表达水平按AxyPrep总RNA小量制备试剂盒说明书提取各组细胞总RNA；然后按照逆转录试剂盒操作步骤将mRNA逆转录合成cDNA(反应条件：37℃孵育60 min，85℃孵育5 min，冰浴5 min)；再通过普通PCR扩增仪，以cDNA为模板，获得目的基因。PCR反应体系：模板1 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、DDH2O 9.5 μL。反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，扩增30个循环后，72℃延伸5 min，4℃保存。内参β-actin的引物，上游序列：5′-GTCCCTGTATGCCTCTGGTC-3′，下游序列：5′-GGTCTTTACGGTTGTCAACG3′(458 bp)；目的基因ANP的引物，上游序列：5′-TGAGCTTCCTCCTTTTACTG-3′，下游序列：5′-CTCAGCTTGCTTTTTAGGAG-3′(322 bp)；MLC-2v引物序列：上游引物5′-GCACCTAAGAAAGCAAAGAA-3′，下游引物：5′-AGGGTCAAACACTTTGAATG-3′(321 bp)。采用1.2%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析，通过凝胶成像系统，对电泳结果进行拍照、记录结果。以目的基因与内参β-actin的灰度值之比表示mRNA表达水平。

2　结　果

2.1c-Kit细胞免疫荧光鉴定分析在IX71倒置荧光显微镜下观察可见：c-Kit抗原偶联的FITC呈绿色荧光表达，c-Kit抗原表达的CSC见图1A(插页四)；通过Hoechst33342荧光染色，染成蓝色的细胞核见图1B(插页四)。

2.2CSC纯度分析P0代细胞c-Kit阳性细胞较少、CD34阳性细胞和杂细胞相对较多，随着细胞传代次数增加，c-Kit阳性细胞百分比明显升高；到P3代时，大多数细胞均为c-Kit阳性，而CD34阳性细胞和杂细胞百分比共占约4.8%，说明细胞经过4次传代后得到纯化的CSC。见表1。

表1CSC纯度分析

Cellc⁃KitCD34ParenchymacellsP06．23±1．3832．78±4．0860．98±6．20P113．26±2．7615．90±2．8971．84±5．45P250．83±4．255．28±1．9844．02±5．02P395．27±3．082．08±0．322．73±0．59

2.3各组细胞上清液中ANP和MCL-2v表达水平与空白对照组比较，5-氮胞苷组、鹿茸多肽组和联合组细胞上清液中ANP 及MCL-2v表达水平明显升高(P<0.05)。见表2。

表2各组细胞上清液中ANP和MLC-2v表达水平

Tab.2Expression levels of ANP and MLC-2v in cell supernatant in various groups

GroupANPMLC⁃2vBlankcontrol248．63±28．3632．98±5．605⁃Azacytidine378．25±52．58∗48．05±4．68∗Piloseantlerpolypep⁃tides306．28±43．50∗45．22±5．39∗Combined422．58±50．06∗58．65±6．03∗

*P<0.05 compared with blank control group.

2.4各组细胞中ANP和MCL-2v mRNA表达水平与空白对照组比较，5-氮胞苷组、鹿茸多肽组和联合组ANP 和MCL-2v mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。见图2和表3。

3　讨　论

心肌损伤伴随临床多种疾病的发生和发展，保护和增加心肌细胞数目对维持心肌结构的完整和心脏功能的稳定有积极的意义，药物诱导多能干细胞分化为心肌细胞进而修复受损心肌是国内外研究[8-10]的热点。研究[11]表明：胚胎干细胞、间充质干细胞和脂肪干细胞等在不同条件下均可诱导分化为心肌细胞，但存在诱导条件相对复杂、稳定性差等缺点。CSC是存在于心脏中的自体心肌干细胞，在正常状态下基本处于“休眠”状态，一旦心肌受损或心脏功能发生病理学改变，其在短时间内快速分化为心肌细胞，对于修复受损心肌具有重要意义[12]。

目前干细胞移植技术尚不成熟，使用适当的药物诱导促进干细胞分化成为可行方案。化学合成药

M:DNA ladder；Lane 1:Blank control group；Lane 2:5-Aza cytidine group；Lane 3:Pilose antler polypeptides group；Lane 4:Combined group.

图2RT-PCR法检测各组细胞中ANP和MCL-2v mRNA表达电泳图

Fig.2Electrophoregram of expressions of ANP and MCL-2v mRNA in cells in various groups detected by RT-PCR method

表3各组细胞中ANP 和MCL-2v mRNA表达水平

GroupANPmRNAMCL⁃2vmRNABlankcontrol0．53±0．130．69±0．155⁃Azacytidine0．77±0．11∗1．10±0．24∗Piloseantlerpolypep⁃tides0．71±0．10∗0．93±0．21∗Combined0．88±0．14∗0．91±0．25∗

*P<0.05 compared with blank control group.

如5-氮胞苷是经典的干细胞诱导剂，可以诱导多种干细胞分化，但作为化学药物，其具有一定的毒性，长期使用可能诱导细胞变异甚至死亡[13-14]。中药单体或有效成分作为干细胞诱导剂与化学合成药物相比，具有种类多、来源广和效果明显的特点，且少有毒性报道[15-16]。中医临床上治疗冠心病多采用温通心阳法，而鹿茸是核心药材之一，鹿茸多肽是鹿茸主要药效学物质，具有明显促进细胞再生作用[17]。ANP是利钠利尿肽，为心脏循环激素，由心房心肌细胞合成、分泌，而MLC-2v特定表现在心室细胞中，二者在胚胎心脏发育形成过程中起很重要的作用[18-21]。

本研究结果显示：鹿茸多肽可以明显提高CSC中 ANP和MLC-2v 表达水平，提示其可以作为干细胞诱导剂促进CSC分化，且与5-氮胞苷联合应用可以在一定程度上降低其毒性。

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