五味子脂A联合卡铂对人卵巢癌Skov3细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用及其机制

上官梦原，赵　菁，杨艳荣，张佳悦，陈俊宇，赵淑华

(1.吉林大学第二医院妇产科，吉林 长春 130041； 2.延边大学附属医院妇产科，吉林 延吉 133000；3.吉林大学基础医学院病理生理学系，吉林 长春 130021)

卵巢癌是病死率最高的妇科恶性肿瘤，侵袭和转移是患者治疗失败的主要原因，有效控制肿瘤的侵袭和转移是治疗的关键。铂类是治疗卵巢癌的主要化疗药物，但具有选择性差、不良反应强和易产生耐药等缺点。近年来，从中药材中筛选有效成分逆转肿瘤多药耐药、增强肿瘤细胞化疗敏感性成为研究热点。研究[1-3]发现：五味子有效成分可发挥抗肿瘤作用。本研究选取五味子化学成分五味子脂A(gomisin A,GA)作为研究对象，观察其与卡铂(carboplatin,CBP)联合应用对卵巢癌Skov3细胞增殖、侵袭和转移能力的影响，并初步探讨其作用机制，为更加合理、有效的临床化疗联合用药方案提供实验依据。

1　材料与方法

1.1细胞和主要试剂人卵巢浆液性乳头状囊腺癌Skov3细胞株由吉林大学前列腺疾病防治中心保存。GA(纯度98%)购于上海源叶生物制品有限公司，注射用卡铂注射液为齐鲁制药有限公司生

产，IMDM 培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司，RT-PCR试剂盒购于大连宝信生物工程有限公司，Transwell侵袭转移实验试剂盒购于美国Millipore公司。

1.2细胞培养和分组人卵巢癌Skov3细胞株用含10% FBS 的IMDM培养液，并置于37℃、5%CO2培养箱中培养，每隔3 d传代1次，传代比率 1∶3，取对数生长期状态良好的细胞进行实验。研究分2步：首先选择不同浓度GA和CBP(GA浓度分别为0、0.01、0.02、0.04、0.08和0.16 μmol·L-1，CBP浓度分别为0、4、8、16、32和64 mg·L-1)单独应用和分别组合后观察其对Skov3细胞增殖能力的影响，然后根据其结果选择联合用药的合适浓度，分为对照组、GA(0.04 μmol·L-1)组、CBP(16 mg·L-1)组、GA(0.04 μmol· L-1)联合CBP(16 mg·L-1)组(GA+CBP组)进行后续实验。

1.3MTT法检测细胞增殖能力取对数生长期细胞，消化细胞后制备单细胞悬液，细胞计数，调整细胞密度为3 000个/孔，接种于96孔板，每孔100 μL，于37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h。分为对照组、GA组、CBP组和GA+CBP组，每组设6个复孔。加药后5%CO2、37℃条件下继续孵育。细胞给药48 h后，每孔加入MTT(5 g·L-1) 10 μL，37℃孵育4 h，小心吸去培养液，每孔加入DMSO溶液150 μL。振荡10 min，用酶标仪于490 nm波长处检测各孔吸光度(A)值。实验重复3次。细胞增殖抑制率=(1/实验组A值-1/对照组A值)×100%。

1.4平板克隆形成实验检测细胞形成克隆能力将Skov3细胞接种至6孔板，细胞密度为500个/孔，实验分为对照组、GA组、CBP组和GA+CBP组，48 h后吸去培养基，PBS洗涤3次，结晶紫染色。观察各组集落形成情况，在显微镜(低倍镜)下计数大于10个细胞的克隆数。按公式计算克隆形成率，并拍照记录。克隆形成率=(细胞克隆数/接种细胞数)×100%。

1.5细胞划痕实验检测细胞迁移能力将Skov3细胞接种于6孔板，细胞密度为3×105个/孔，待细胞生长至约80%融合，用200 μL移液枪头沿无菌格尺在每孔中央部纵向划痕，除去培养液，加入2 mL PBS仔细洗涤3次，37℃、5% CO2继续培养24 h后给药。实验分为对照组、GA组、CBP组和GA+CBP组，给药后观察细胞生长迁移情况，并拍照记录。

1.6Transwell实验检测细胞侵袭和转移能力无血清培养基饥饿细胞12～18 h后，消化细胞并用无血清IMDM重悬细胞，调整细胞浓度为2×104mL-1。Transwell试剂盒室温放置30 min预温，将小室置于24孔板中，加入300 μL无血清培养基至上室内部，室温下水化细胞外基质(ECM)30 min后，吸弃250 μL培养基。向每个上室加入无血清细胞悬液250 μL，向下室加入含10%胎牛血清的IMDM 500 μL。上室、下室分别加药至同等浓度，继续孵育30 h。取出小室移除残留培养液，PBS洗涤2次，瑞氏-姬姆萨染色后，倒置显微镜观察并拍照记录。

1.7Real-time PCR检测Skov3细胞中MMP-2和MMP-9 mRNA表达水平将Skov3细胞接种于6孔板，给药孵育48 h后，使用Trizol试剂盒提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA水平，逆转录成cDNA。PCR引物序列：MMP-2上游引物5′-TGATCTTGACCAGAATACCATCGA-3′，下游引物5′-GGCTTGCGAGGGAAGAAGTT-3′；MMP-9上游引物5′- CCTGGAGACCTGAGAACCAATC-3′，下游引物5′-CCACCCGAGTGTAACCATAGC-3′；GAPDH 上游引物5′-GGAAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物5′-AGAAGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。以cDNA为模板进行Real-time PCR检测，扩增条件：94℃、3 min；94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、45 s，40个循环；72℃、5 min。以GAPDH为内参照，通过2-ΔΔCt计算各基因的mRNA表达水平。

1.8Western blotting法检测Skov3细胞中MMP-2、MMP-9、AKT1和pAKT1蛋白表达水平在100 mm培养皿中接种细胞，给药后继续孵育48 h。离心收集细胞，加入细胞裂解液，充分裂解细胞，离心收集上清，采用BCA 法测定蛋白含量。SDS-PAGE 电泳分离蛋白样本中不同相对分子质量蛋白，将蛋白转印到PVDF 膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h，TBST洗3次，孵育一抗，抗体稀释比例分别为MMP2(1∶1 000)、MMP9(1∶1 000)、AKT1(1∶1 000)、pAKT1(1∶1 000)和β-actin(1∶500)，4℃过夜。TBST洗3次后，加入过氧化物酶标记二抗，37℃孵育1 h，TBST洗3次。DAB显色，凝胶成像系统拍照。以各实验组与对照组灰度值之比表示蛋白相对表达水平。

2　结　果

2.1各组细胞增殖抑制率随着浓度的增加，GA和CBP对Skov3细胞增殖抑制率明显升高。单独应用GA(0.01、0.02、0.04、0.08和0.16 μmol·L-1)干预后，Skov3细胞增殖抑制率为9.4%～21.3%；单独应用CBP(4、8、16、32和64 mg·L-1)干预后，Skov3细胞增殖抑制率为14.6%～27.2%，而联合作用后细胞增殖抑制率最高为52.1%，高于同浓度GA组和CBP组(P<0.01)，且GA和CBP浓度分别为0.04 μmol·L-1和16 mg·L-1时量效比最佳。见图1。

n=6,*P<0.01 compared with GA group;△P<0.01 compared with CBP group.

图1不同浓度GA和CBP组Skov3细胞增殖抑制率

Fig.1 Inhibitory rates of proliferation of Skov3 cells in GA and CBP groups with different concentrations

2.2各组细胞克隆形成率对照组、GA组、CBP组和GA+CBP组克隆形成率分别为60%、42%、31%和19%。与对照组比较，GA组Skov3细胞克隆形成率有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；CBP组和GA+CBP组克隆形成率明显降低 (P<0.05或P<0.01)。与GA组和CBP组比较，GA+CBP组细胞克隆形成率明显降低(P<0.01)。见图2。

2.3各组细胞的转移能力与对照组比较，GA和CBP组Skov3细胞转移的数量均减少，划痕的愈合面积减少；GA+CBP组Skov3细胞迁移的数量明显低于GA和CBP组，且细胞呈现明显受抑制状态。见图3。

A：Control group;B：GA group;C：CBP group;D：GA+CBP group.

A：Control group;B：GA group;C：CBP group;D：GA+CBP group.

2.4各组细胞的侵袭能力与对照组比较，GA和CBP组Skov3细胞穿过ECM的能力降低，穿过并黏附于QCM TM膜的细胞减少；GA+CBP组Skov3细胞穿过ECM的能力进一步降低，穿过并黏附于QCM TM膜的Skov3细胞进一步减少。见图4(插页五)。

2.5各组细胞中MMP-2和MMP-9 mRNA表达水平与对照组比较，GA和CBP组MMP-2和MMP-9 mRNA表达水平降低(P<0.05)；与GA组和CBP组比较，GA+CBP组MMP-2和MMP-9 mRNA表达水平明显降低(P<0.01)。见表1。

表1各组Skov3细胞中MMP-2和MMP-9 mRNA表达水平

GroupMMP⁃2MMP⁃9Control0．99±0．210．98±0．22GA0．95±0．23∗0．90±0．22∗CBP0．78±0．20∗0．77±0．20∗GA+CBP0．55±0．10△#0．30±0．10△#

*P<0.05 compared with control group;△P<0.01 compared with GA group;#P<0.01 compared with CBP group.

2.6各组细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平与对照组比较，GA和CBP组细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01)；与GA组和CBP组比较，GA+CBP组细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。见图5和表2。

Lane 1：Control group;Lane 2：GA group;Lane 3：CBP group;Lane 4：GA+CBP group.

图5Western blotting法检测各组Skov3细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达电泳图

Fig.5Electrophoregram of expressions of MMP-2 and MMP-9 proteins in Skov3 cells in various groups

表2各组Skov3细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平

GroupMMP⁃2MMP⁃9Control0．40±0．031．09±0．06GA0．33±0．04∗0．68±0．03∗∗CBP0．22±0．03∗∗0．42±0．04∗∗GA+CBP0．13±0．06△#0．50±0．04△#

*P<0.05 compared with control group;△P<0.01 compared with GA group;#P<0.01 compared with CBP group.

2.7各组细胞中AKT1和pAKT1蛋白表达水平与对照组比较，GA和CBP组细胞中AKT1和pAKT1蛋白表达水平降低(P<0.05)；与GA和CBP组比较，GA+CBP组细胞中AKT1和pAKT1蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。见图6和表3。

Lane 1：Control group;Lane 2：GA group;Lane 3：CBP group;Lane 4：GA+CBP group.

图6各组Skov3细胞中AKT1和pAKT1蛋白表达电泳图

Fig.6Electrophoregram of expressions of AKT1 and pAKT1 proteins in Skov3 cells in various groups

表3各组Skov3细胞中AKT1和pAKT蛋白表达水平

GroupAKT1pAKT1Control0．69±0．030．44±0．05GA0．60±0．03∗0．54±0．02∗CBP0．30±0．02∗0．27±0．02∗GA+CBP0．23±0．01△#0．14±0．02△#

*P<0.05 compared with control group;△P<0.01 compared with GA group;#P<0.01 compared with CBP group.

3　讨　论

化疗是卵巢癌辅助治疗的重要手段，虽然术后辅助化疗药物不断创新，但是对卵巢癌的治疗效果并不理想。CBP是目前广泛应用的化疗药物之一 ，但存在严重的不良反应并易产生耐药，因此急需开发毒性小、治疗效果好的新型抗肿瘤药物，以降低肿瘤患者死亡率。近年来，天然、高效、低毒和来源广泛的中草药受到国内外学者的青睐。五味子具有广泛的药理成分，其抗肿瘤活性已被许多研究[4-6]所证实。

肿瘤的发生发展与细胞的增殖能力有关。Kim等[7]研究发现：五味子脂可抑制乳腺癌细胞增殖，其机制可能是抑制细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E和细胞周期蛋白依赖性激酶CDK2、CDK4的表达。有研究[8]显示：随着五味子多糖浓度升高可明显抑制卵巢癌Skov3细胞增殖。本课题组前期实验[9]显示：单独使用GA和CBP均可抑制人卵巢癌Skov3细胞增殖，二者联合应用后抑制作用更为明显，进一步证实GA可增强CBP对人卵巢癌Skov3细胞增殖的抑制作用,即以低浓度CBP与微量GA联合用药可达到高浓度CBP所产生的抑瘤效果，从而降低CBP的用量、减少其不良反应。克隆形成率可反映细胞群体依赖性和增殖能力2个重要性状，多被用于抗癌药物的敏感性试验[10]。本研究通过平板克隆实验发现：GA+CBP组Skov3细胞增殖能力被明显抑制。PI3K-AKT信号通路是重要的细胞信号转导通路，通过激活多个下游效应分子，与多种肿瘤的发生发展密切相关。研究[11]显示：与正常肝组织比较，肝癌细胞中AKT和pAKT的表达水平明显升高，且随肿瘤组织的临床病理分期、分化程度不同而变化。在卵巢癌中，AKT过表达增加细胞的侵袭和转移能力[12]；目前研究[13-15]表明：PI3K-AKT信号通路促进肿瘤发生的机制可能是某些因素导致了蛋白激酶B(AKT)的过度活化。通过应用PI3K-AKT抑制剂阻断PI3K-AKT途径，可提高卵巢癌细胞株对化疗药物的敏感性[16]。本研究采用Western blotting法检测药物处理后Skov3细胞中AKT1和p-AKT1蛋白水平，结果显示：GA+CBP组细胞中AKT1和p-AKT1蛋白表达水平明显降低，提示GA可增强CBP对PI3K-AKT途径的抑制作用，从而发挥协同抗肿瘤作用。

肿瘤细胞的迁移是肿瘤细胞生长和扩散的一种方式，黏附和侵袭过程增加了恶性肿瘤的增殖、转移能力。肿瘤细胞体内转移需穿过ECM，继而向组织浸润，因此ECM和基底膜的降解是肿瘤侵袭、发展和转移扩散过程的重要组成部分[17]。 本研究通过细胞划痕实验和Transwell实验发现：联合用药后细胞迁移能力明显减弱，提示联合用药后抑制细胞侵袭、转移的能力增强。肿瘤细胞降解ECM主要依赖蛋白水解酶，其中基质金属蛋白酶(MMPs)可降解胞外基质和基底膜，诱导肿瘤扩散和转移,其中最具代表性的是MMP-2和MMP-9。研究[18]发现：当MMP-2和MMP-9的表达或活性降低时，高转移性的细胞侵袭能力会明显减弱。已有研究[19-21]表明：在卵巢恶性肿瘤中，MMP-2和MMP-9的过表达与肿瘤浸润、转移扩散和预后不良密切相关。本研究结果显示：GA+CBP组细胞内MMP-2和MMP-9 mRNA及蛋白表达水平降低更加明显，支持联合用药增强细胞的抗侵袭和抗转移能力的结论。

综上所述，GA可通过抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等多个环节从而增强CBP的抑瘤作用，其机制可能为抑制MMP-2和MMP-9 mRNA及蛋白的表达，但其调控表达的分子机制还需进一步研究。

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