二氢生物喋呤还原酶减轻脂肪酸诱导的细胞凋亡的机制研究

古艳婷，冯 茹，孙斯凡

糖尿病肾病是由很多因素导致的疾病，患者体内存在多种通路的失调，至今仍未完全阐明。研究显示糖尿病肾病存在自噬现象的下调，其中肾脏中的脂代谢紊乱会促进肾小球硬化和肾小管间质纤维化[1-2]，且会导致肾小管细胞凋亡[3]。研究者在前期实验中发现，二氢生物喋呤还原酶(dihydropteridine reductase，QDPR)在体外高表达可抑制细胞的氧化应激，但其对活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的抑制是否参与糖尿病肾病的发生发展还不确定[4]。本研究构建了野生型QDPR重组质粒并转染至HEK293T细胞，使用脂肪酸(plamitic acid, PA)刺激细胞，观察QDPR过表达对PA诱导的细胞凋亡作用的影响，探讨QDPR在糖尿病肾病发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1主要试剂及细胞鼠单抗V5抗体(美国Invitrogen公司)；兔多抗LC3(美国Sigma公司)，兔多抗Beclin 1抗体(美国Sigma-Aldrich公司)，二抗(美国Abcam公司)；凝胶回收纯化试剂盒、质粒中提试剂盒(德国QIAGEN公司)；限制性内切酶EcoR V、Pst I、Xba I(美国NewEngland Biolabs公司)；四氢生物喋呤(tetrahydrobiopterin，BH4)检测试剂盒(北京antibody-online公司)，ROS检测试剂盒(北京Applygen有限公司)。HEK293T细胞为航空总医院中心实验室保存。

1.2QDPR重组质粒的构建在大鼠QDPR引物上游和下游分别引入EcoR V酶切位点和 Xba I 酶切位点。引物序列如下：上游5′-AGATATCTGGCGGCTTCGGGCGAGGC-3′；下游5′-ATCTAGAGAAATAGGCTGGAGTAAGCT-3′，PCR反应条件为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s；54 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min。经双酶切后再使用T4 DNA连接酶连接目的片段与载体，构建rQDPR/pcDNA3.1/V5-His重组质粒。

1.3HEK293T细胞转染及分组实验分为A、B、C 3组，A组为空载体组， B组为经过PA刺激的空载体转染组，C组为经过PA刺激的QDPR重组质粒转染组。HEK293T细胞常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，转染前24 h传代，以2×106/孔的细胞密度接种于6孔板中，在37 ℃、5% CO2条件下培养24 h，细胞贴壁后利用磷酸钙共沉淀法转染。转染24 h后，空载体组换成正常培养基，B组和C组加入含浓度为0.5 mmol/L PA的培养基。培养24 h后收集细胞液和细胞进行检测。

1.4BH4和ROS生成量检测使用BH4试剂盒检测细胞和细胞液中BH4的含量。在细胞中加入含有1 mmol/L DCFH-DA的培养基，然后在37 ℃条件下孵育30 min，随后用PBS清洗2次，使用荧光显微镜观察并计数。

1.5Westernblot检测各组取60 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳并电转移至PVDF膜，5 g/L脱脂奶粉封闭2 h，TBST洗膜，分别用鼠单抗V5抗体 (1 ∶5 000)、Caspase 3抗体(1 ∶2000)、 Beclin1抗体(1 ∶2 000)、Beclin2抗体(1 ∶2 000)及β-actin 抗体(1 ∶2 000) 4 ℃孵育过夜；使用浓度为1 ∶4 000的二抗孵育1 h，TBST洗膜3次后ECL显影。采用Image J软件分析条带光密度值, 并计算各指标与β-actin光密度值的比值。

2 结果

2.1QDPR融合蛋白成功表达用鼠单抗V5抗体检测到C组QDPR融合蛋白的表达，A组以及B组未见目的蛋白表达，见图1。

图1 Western blot检测转染后QDPR融合蛋白表达

2.2QDPR过表达对BH4含量的影响与B组相比，C组细胞和细胞液中BH4的含量明显增多(P<0.05)，A组以及B组之间BH4的生成量差异无统计学意义。见图2。

图2 QDPR过表达对BH4含量的影响与B组比较：##P<0.01

2.3QDPR过表达对PA诱导的ROS生成的影响PA刺激HEK293T细胞后，B组内ROS生成增多，QDPR过表达(C组)显著减少PA诱导的ROS生成，三组间F=263.95，可见QDPR显著降低ROS的生成。见图3。

图3 QDPR过表达对PA诱导的ROS生成的影响与A组比较：**P<0.01；与B组比较：##P<0.01

2.4QDPR过表达对PA诱导的细胞凋亡通路分子改变的作用经过0.5 mmol/L PA刺激细胞24 h后，Western blot法检测结果显示：与A组相比，B组经过PA刺激后细胞中Beclin 1和Caspase 3表达水平显著上调(P<0.05)，Beclin 2表达水平下降(P<0.05)；QDPR过表达后，与B组比较，C组Beclin 1和Caspase 3表达水平显著下调(P<0.05)，Beclin 2表达水平升高 (P<0.05)。见图4。

图4 QDPR过表达对细胞凋亡通路分子蛋白表达的影响±s)

3 讨论

QDPR在BH4再生过程中起到重要作用，并对维持体内BH4含量稳定有很重要意义[5]。而BH4是三种一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)激活所必需的辅助因子，当BH4在体内的含量不足时，NOS会产生脱偶联导致ROS生成增多[6]。ROS又与糖尿病肾病的发生关系密切[7]。所以笔者提出假设QDPR可能通过BH4来调节ROS的含量，继而影响细胞的自噬功能。课题组在前期差异蛋白质组学研究[8]中发现，在糖尿病肾病发展过程中，QDPR发生了突变，并且可以调节氧化应激过程与肾脏纤维化过程。但QDPR是否参与细胞凋亡的发生发展有待进一步研究。

糖尿病肾病患者的体内存在明显的PA紊乱，糖尿病肾病患者体内PA增高会导致氧化应激、炎症等通路的激活，这些通路的激活都参与了糖尿病肾病的发生发展[9]，高浓度的PA在肾脏中聚集还能诱导肾小管上皮细胞产生自噬并发生凋亡[10-11]。凋亡是由十分复杂的信号转导通路调控的，细胞凋亡的分子机制中重要的效应因子是Caspase家族。Caspase 3是评价哺乳动物凋亡的关键蛋白酶，它降解凋亡过程中标志性底物的活性最强，同时，也可以通过调节下游分子的表达来介导细胞的凋亡[12]。此外，抑制凋亡的家族成员(Bcl-2)是主要抗凋亡因子[13-14]。近年来有研究[15]显示在链脲佐菌素诱导的1型糖尿病肾病大鼠肾组织中存在着细胞凋亡活性的下调，包括促细胞凋亡基因表达较少以及抑制细胞凋亡基因表达增加。Beclin家族中的Beclin-2可以防止凋亡产生，是体内调控细胞凋亡的基因之一，它通过调节凋亡相关蛋白来达到抑制凋亡的目的。而Beclin 1是作为Beclin 2的交互蛋白被分离出来的，Beclin 1拥有与Beclin 2相似的结构域，之后发现Beclin 1有促凋亡的作用，并且随着细胞内ROS的生成，和Vps-Beclin 1复合体有关的自噬也被启动，从而引起凋亡[16]。本研究结果显示转染野生型QDPR重组质粒后细胞中Beclin 2蛋白水平显著增高，Beclin 1和Caspase 3的表达明显降低，提示QDPR可能有诱导细胞凋亡的作用，由此推测QDPR可能和糖尿病肾病的发生发展有关，并且课题组发现的QDPR可能是通过氧化应激通路来调节细胞凋亡，但是它的具体分子机制还不清楚，有待进一步研究。

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