淫羊藿提取物对急性髓系白血病SCID小鼠模型细胞生物学特性的影响*

柯 鸿武伦 王黎

（湖北医药学院附属人民医院，湖北 十堰 442000）

急性髓细胞白血病（AML）是由来源于骨髓的祖细胞或干细胞恶性转化造成的克隆性血液系统肿瘤，表现为造血祖细胞或干细胞增殖过度、分化障碍或细胞凋亡受抑［1］。目前对AML的治疗以化疗为主，但化疗产生的耐药性及严重不良反应限制了它的临床使用，而造血干细胞移植虽可以治愈大多数白血病，但受制于骨髓移植源少、费用高昂及手术死亡率高等诸多不利因素，常达不到治愈目的。而中医中药在治疗肿瘤方面有一定的效果，因此，研究传统中药治疗AML十分必要。临床常用的中药淫羊藿为小檗科植物心叶淫羊藿，常用于治疗半身不遂、腰酸腿痛、阳痿早泄、四肢麻木、神经衰弱、健忘、目眩耳鸣等［2-3］。国内外大量研究表明，淫羊藿的主要药理成分黄酮类生物碱——淫羊藿苷具有抗肿瘤、促进间充质干细胞增殖及迁移、抑制肿瘤细胞生长、迁移、侵袭和促细胞凋亡作用［4-6］。在血液系统肿瘤研究中，目前有实验证实淫羊藿可抑制AML细胞株HL-60的增殖并诱导细胞凋亡和分化［7-8］。由于细胞增殖与凋亡平衡关系失调是AML发生的根本原因，因此，本研究以AML细胞株HL-60为靶细胞，采用腹腔注射的方法建立AML模型，观察淫羊藿提取物体内对AML细胞株HL-60的抑制作用，为寻找治疗AML潜在的有效药物提供理论依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级，SCID小鼠60只，雌雄各半，7~8周龄，体质量20~22 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号：SCXK（京）2017-019。动物房要求恒温20~22℃，恒湿60%~70%，5只1笼喂养，自然光照，自由饮纯净水，食料高压灭菌。

1.2 药物及试剂 1）淫羊藿提取物的提取。取干燥淫羊藿生药200 g，加400 mL双蒸水浸泡1 h，采用加热提取法得到200 mL水煎剂，制成的生药水煎提取液置4℃冰箱保存备用。淫羊藿提取物由湖北医药学院附属人民医院药学部提取。阿糖胞苷标准品购自上海源叶生物科技有限公司；AML细胞株HL-60购自上海抚生实业有限公司；同源性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）、多聚腺苷二磷酸核糖多聚酶（PARP）ELISA试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）；胎牛血清和RPMll640培养液（赛默飞）；环磷酰胺注射液（上海瀚香生物科技有限公司）；DAB试剂盒和小鼠抗人CD13和CD71单克隆抗体 （北京中山生物技术有限公司产品）。

1.3 细胞培养 取出冻存AML细胞株HL-60的冷冻管速融，37℃解冻，细胞培养箱通5%CO2，恒温37℃，解冻后HL-60接种于含100 mg/L链霉素、100 U/mL青霉素G和10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。常规传代培养3 d，EDTA消化后注入离心管，1000 r/min低速离心5 min，收集AML细胞株HL-60调制成细胞数密度为1×107的细胞悬液备用。

1.4 造模与分组 60只小鼠随机选取其中的50只，再随机分为模型组、阿糖胞苷组、观察1组、2组和3组，另10只正常小鼠设为空白对照组。将模型组、阿糖胞苷组、观察1组、2组和3组SCID小鼠移出，在超净台上，按100 mg/kg体质量的环磷酰胺腹腔注射预处理，每日1次，注射2 d，第3日取备用的AML细胞株HL-60细胞悬液，均从小鼠右侧腹部皮下单点注射（1×107/鼠），空白对照组不做处理。注射后第3周以肝脾出现肿瘤浸润、外周血白细胞达（4.03±1.92）×109/L为成瘤标准［9］。在造模的预实验中，平均成瘤时间为（14.63±2.74） d，平均生存时间达（54.36±6.97） d，说明这种方法造模简单，成瘤率高 （本实验成瘤率为100%），并能更真实、直观地观察白血病细胞在肝、脾、肺等内脏器官的浸润及转移情况。

1.5 给药方法 注射AML细胞株HL-60细胞悬液后第3周最后1 d，观察1组、2组和3组分别用淫羊藿提取物，按10、5、2.5 mL/kg灌胃 5周，模型组和空白对照组灌胃等体积0.9%氯化钠注射液5周。阿糖胞苷组尾静脉注射阿糖胞苷标准品 100 mg/（m2·d），每日 1次，共治疗5 d。

1.6 标本采集与检测 1）外周血白细胞计数及分类。在治疗结束时取尾静脉血0.1 mL，用人工计数法计数白细胞、红细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和HL-60细胞总数。2）流式细胞分析仪检测CD13和CD71表达率及细胞各周期细胞百分率。在治疗第5周最后1 d，处死小鼠，摘取肝、脾组织，制成组织匀浆细胞悬液，加鼠抗人CD13-PE和CD71-PE，阴性对照加羊抗小鼠IgG-PE标记，4℃下避光染色30 min，PBS液洗2次，按试剂盒操作进行流式细胞学 （FCM）检测CD13和CD71阳性表达率。取尾静脉血0.1 mL，用红细胞裂解液去除红细胞制成单细胞悬液，用PBS液洗2次，75%乙醇固定，12 h后采用FCM方法上样进行检测，并用Cell Quest析软件分析各组G1和S期HL-60细胞所占百分率。3）Western blotting检测PTEN和PARP蛋白表达。称取小鼠脾脏组织约100 mg，剪碎后匀浆，提取总蛋白质进行电泳分离。电泳分离时在100 V恒压下电泳20 min，150 V恒压下电泳60 min，250 mA下电转膜90 min，然后将蛋白质转移到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，分别加入Ⅰ抗兔抗人PTEN和PARP单克隆抗体10 mL，4℃过夜。然后加入生物素化Ⅱ抗，室温2 h后加ABC复合物，室温下消化30 min，再后再加DAB显色液显色。以β-actin为内参，以目的基因灰度值/β-actin灰度值之比值表示相应基因的相对值。

1.7 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件。实验数据以（±s）表示，先进行单因素方差分析，组间差异则采用两样本均数t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠外周血白细胞计数及分类比较 见表1。FCM检测显示，模型组白细胞、淋巴细胞和HL-60细胞总数升高，中性粒细胞降低，与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，阿糖胞苷组白细胞、淋巴细胞和HL-60细胞总数明显降低，中性粒细胞升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。观察2组和观察3组这一作用与阿糖胞苷组相似，与模型组比较各指标差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组小鼠外周血白细胞计数及分类比较（±s）

表1 各组小鼠外周血白细胞计数及分类比较（±s）

与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同。

组别 n空白对照组 1 0模型组 1 0阿糖胞苷组 1 0白细胞（1 0 9/L）中性粒细胞（%）淋巴细胞（%）H L-6 0细胞（%）5.0 3±0.2 1 3.5 1±0.2 0 7 0.5 6±5.2 3 0 1 0.2 1±1.6 4* 1.6 9±0.1 1* 8 6.6 4±7.5 1* 1 7.8 2±1.9 6*4.6 7±0.8 6△ 3.0 2±0.2 5△ 6 8.9 4±8.4 3△ 5.4 6±0.7 2△观察 1组 1 0 9.7 5±1.2 7 1.8 6±0.1 7 8 4.8 6±6.9 7 1 5.1 4±1.7 5观察 2组 1 0 7.4 8±1.0 4△ 3.4 2±0.1 4△ 7 2.4 2±5.8 4△ 6.3 8±1.0 2△观察 3组 1 0 5.1 3±0.7 1△ 3.8 6±0.2 2△ 7 3.5 1±7.2 1△ 6.0 6±0.6 5△

2.2 各组小鼠CD13和CD71表达率和HL-60细胞各周期细胞百分率比较 见表2。与空白对照组比较，模型组在治疗第5周G1期HL-60细胞百分率明显降低，CD71和CD13表达率明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，阿糖胞苷组G1期HL-60细胞百分率明显升高，CD71和CD13表达率和S期HL-60细胞百分率明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。观察2组和观察3组这一作用与阿糖胞苷组相似，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），且观察2组和观察3组G1和S期HL-60细胞百分率呈浓度效应关系。

2.3 各组小鼠PTEN和PARP相对表达量比较 见表3。与空白对照组比较，模型组PTEN明显降低，PARP明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，阿糖胞苷组PTEN明显升高，PARP明显降低（P＜0.05）。观察2组和观察3组这一作用与阿糖胞苷组相似，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组小鼠CD13和CD71表达率和HL-60细胞各周期HL-60细胞百分率比较（%，±s）

表2 各组小鼠CD13和CD71表达率和HL-60细胞各周期HL-60细胞百分率比较（%，±s）

与观察 2组比较，▲P＜0.05。

组别 n空白对照组 1 0模型组 1 0阿糖胞苷组 1 0 C D 7 1 C D 1 3 G 1期 S期0.2 3±0.0 2 3.7 5±0.2 7 5 0.5 2±3.1 8 3 9.8 4±4.9 5 3.5 9±0.1 3 8.5 7±0.5 4 3 5.9 4±1.9 3 3 7.5 7±3.1 2 0.3 7±0.0 3△ 3.6 9±0.1 3△ 7 8.4 6±6.2 5△ 1 4.8 3±1.9 4△观察 1 组 1 0 3.0 3±0.2 4 7.9 1±0.7 6*5 2.4 6±3.2 2 3 6.1 5±3.0 4观察 2 组 1 0 1.5 8±0.1 2△ 5.1 4±0.2 2△ 6 7.4 6±5.8 4△ 2 0.3 4±1.5 7△观察 3 组 1 0 0.7 1±0.0 5△ 4.0 1±0.1 9△ 7 6.5 3±6.9 1△▲ 1 5.5 2±1.2 1△▲

表3 各组小鼠PTEN和PARP相对表达量比较（±s）

表3 各组小鼠PTEN和PARP相对表达量比较（±s）

组 别 n空白对照组 1 0模型组 1 0阿糖胞苷组 1 0 P T E N P A R P 1.7 1±0.1 6 6.4 1±0.2 4 0.9 2±0.0 7* 9.2 7±1.1 4*1.9 7±0.1 8△ 6.8 3±0.5 4△观察 1 组 1 0 0.9 5±0.0 6 9.0 2±0.8 5观察2组 1 0 1.6 8±0.1 1△ 7.9 4±0.7 9△观察3组 1 0 1.7 3±0.1 5△ 7.3 6±0.8 1△

3 讨 论

急性白血病（AL）为儿童最常见的淋巴系统恶性肿瘤，根据癌变细胞类型可分为AML和急性淋巴细胞白血病（ALL）两大类。该病属造血干细胞恶性克隆性疾病，其病理基础是因异常的幼稚白血病细胞和原始细胞大量增殖并蓄积于骨髓而影响到正常造血功能，并在增殖的同时广泛浸润淋巴、肝、脾等脏器，造成严重的出血、贫血、浸润及感染［10］。临床检测表明，儿童AML的骨髓标本中PTEN蛋白表达缺失，PTEN属磷酸酶活性的抑癌基因，在细胞生长信号通路中起重要作用，具有蛋白磷酸酶活性和脂质磷酸酶活性，可通过拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制肿瘤细胞的生长、侵袭［11］。

在本研究中，笔者用阳性药阿糖胞苷组作为阳性对照，发现淫羊藿提取物有与其相似的药理作用，这一作用虽弱于阿糖胞苷，但两者对相关检测指标的作用结果基本一致。在实验中，模型组PTEN低表达，不能有效抑制腹腔接种的AML细胞株HL-60细胞增殖，这是造成肿瘤细胞无序生长的关键。而观察2组、3组PTEN蛋白表达量增加，说明适当剂量的淫羊藿提取物可提高抑癌基因PTEN表达，从而拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性，达到抑制AML细胞株HL-60细胞在SCID小鼠体内生长的作用。PARP存在于真核细胞中，PARP在生理状态下保持染色体结构完整性，参与DNA复制和转录，PARP与细胞的分化、癌化和DNA的修复有关。在白血病的发病过程中，过度激活的PARP可产生大量的聚芳酯，PARP上的丝氨酸磷酸化而失去结合B细胞淋巴瘤/白血病-6基因的能力［12］。模型组PARP高表达，被异常激活的PARP产生大量的聚芳酯，失去结合B细胞淋巴瘤/白血病-6基因的能力，造成腹腔接种的AML细胞株HL-60细胞无限制性增殖。而观察2组、3组PARP明显下降，提示淫羊藿提取物可通过抑制PARP的裂解，阻止PARP磷酸化，从而产生凋亡作用［13-14］，达到抑制HL-60细胞分化和增殖的目的。CD13存在于细胞表面，是检测AML的重要标志物，CD13阳性表明生存率低，是预后不良重要标志［15］。CD71也存在于细胞表面，为转铁蛋白受体，可通过与其配体转铁蛋白结合而介导细胞内铁的摄取和转运，在一定程度上反映细胞的增殖活性。模型组CD13和CD71表达率均高于空白对照组，刺激其与转铁蛋白结合，使细胞内铁的摄取和转运激增促使腹腔接种的AML细胞株 HL-60细胞分化、增殖和浸润。本课题组观察淫羊藿提取物体内对CD13和CD71均有明显的抑制作用。实验结果显示，观察2组、3组CD13和CD71阳性表达率均明显下降，这与朱剑锋等［16］观察到淫羊藿通过抑制CD13和CD71表达率而影响K562细胞的诱导分化作用结果高度一致。另有研究表明，CD71在静止期的淋巴细胞上不表达，在高分化期则高表达，这与本研究中模型组观察到的结果一致，故CD71常被作为AML的重要标志物用于血液肿瘤的诊断及鉴别诊断［17］。本实验观察到观察2组、3组CD13和CD71阳性表达率均明显下降，因此可以推断，淫羊藿提取物通过抑制CD13和CD71表达，并在体内生长因子和有丝分裂原的刺激下，促使细胞从G0期进入G1期，将处于对数生长期肿瘤细胞的阻滞于G1期。

众所周知，所有恶性肿瘤生长的本质就是细胞周期调控紊乱即失控性增殖，目前，在临床上使用的抗癌药大多作用于细胞，可使细胞阻滞在S期或G2/M期［18］。大量抗癌中药及其单体在体外实验中能够诱导细胞周期停滞而发挥抗癌作用［19］。从本实验结果来看，观察2、3组外周血白细胞、淋巴细胞和HL-60细胞总数明显降低，中性粒细胞升高，G1期细胞百分率明显升高，S期细胞百分率明显降低，这提示淫羊藿提取物将两组HL-60细胞阻滞于G1期。

综上所述，淫羊藿提取物有与阳性药阿糖胞苷相似的药理作用，在体内对急性髓系白血病HL-60细胞株有一定的抑制作用，其机制可能通过下调CD13和CD71，裂解PARP以诱导急性髓系白血病细胞凋亡，增强PTEN蛋白表达并促使细胞阻滞于G1期，从而发挥抑制白血病细胞的增殖作用。

［1］ 王孝会，陈芳，符爽，等.儿童急性髓系白血病免疫表型特点分析［J］.现代肿瘤医学，2017，25（16）：2651-2654.

［2］ 李钊，王雄彪.淫羊藿甙的研究进展［J］.现代中西医结合杂志，2015，24（8）：908-910.

［3］ 张淑琴，贠向阳，郑倩，等.淫羊藿素对3种人肿瘤细胞增殖抑制作用的比较［J］.中华实验外科杂志，2015，32（8）：1919-1921.

［4］ 张黎声，韩小晶，罗志荣，等.淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞迁移作用的影响［J］.中国中医药信息杂志，2017，24（2）：44-48.

［5］ Li C，Li Q，Mei Q，et al.Pharmacological effects and pharmacokinetic properties of icariin，the major bioactive component in Herba Epimedii［J］.Life Sci，2015，126（12）：57-68.

［6］ 张温花，张文超，于远东，等.淫羊藿苷对前列腺癌细胞株活力、迁移与侵袭的作用［J］.中国病理生理杂志，2017，33（6）：1017-1020.

［7］ 宋飞，高素君，张云蔚，等.淫羊藿苷对NB4白血病细胞株增殖和凋亡的影响及其作用机制［J］.吉林大学学报：医学版，2015，41（6）：1181-1185.

［8］ 谢超，董伟，温培娥，等.曲古霉素A和淫羊藿甙诱导HL-60细胞分化过程中nm23和c-myc及G-CSF表达变化的研究［J］.中华肿瘤防治杂志，2008，15（7）：481-486.

［9］ 单武林，章成芳，马筱玲，等.不同方法接种构建的SCID小鼠HL-60白血病模型生物学特性分析［J］.安徽医科大学学报，2014，49（6）：837-841.

［10］Creutzig U，van den Heuvel-Eibrink MM，Gibson B，et al．Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in children and adoleseents：recommendations from an international expert panel［J］.Blood，2012，120（16）：3187-3205．

［11］王妍，徐酉华，胡艳妮，等.GSK-3β、PTEN、PLK1 在儿童急性髓系白血病中的表达及意义［J］.重庆医学，2013，42（28）：3347-3349.

［12］尚粉青，闫龙龙，张玎，等.高糖通过调节腺苷酸活化蛋白激酶/聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1的磷酸化抑制B细胞淋巴瘤/白血病-6基因表达的研究［J］.中国糖尿病杂志，2016，24（11）：1012-1015.

［13］潘莉萍，袁伟.淫羊藿苷促进白血病K562细胞凋亡的研究［J］.白血病·淋巴瘤，2016，25（6）：340-343.

［14］朱华宇，李玉洁，吴元胜，等.脱水淫羊藿素与金雀异黄酮对 MCF-7、MDA-MB231细胞株增殖的影响研究［J］.现代中西医结合杂志，2017，26（7）：685-688.

［15］马杰，刘延方，陈胜梅，等.不同年龄段成人急性淋巴细胞白血病免疫表型差异分析［J］.中国实验血液学杂志，2010，18（4）：942-945.

［16］朱剑锋，昊正东，孟坤，等.淫羊藿提取物IC163对K562细胞的诱导分化作用观察［J］.临床血液学杂志，2011，24（5）：300-302.

［17］魏园玉，张晓飐，张帆，等.CD71作为增殖指标在血液肿瘤中的表达及与Ki-67的相关性分析 ［J］.中国实验血液学杂志，2015，23（1）：234-240.

［18］詹启敏，陈杰.细胞周期与肿瘤转化医学［J］.中国肿瘤临床，2014（1）：1-7.

［19］曹玫，欧阳露.植物甾醇的抗肿瘤作用及其机制研究进展［J］.实用药物与临床，2015，18（9）：1104-1107.