Box-Benhnken响应面法优化超声辅助提取川续断挥发油及GC-MS分析

李 涛， 苏 趁

(四川大学 华西药学院， 四川 成都 610041)

川续断为川续断科植物川续断Dipsacus asperoides C.Y.Cheng et T.M.Ai的干燥根，能补肝肾、强筋骨、续折伤、止崩漏等，用于治疗肝肾不足、腰膝酸软、风湿痹痛、跌扑损伤、崩漏和胎漏[1].川续断主产于我国湖北、湖南、江西、广西、云南、贵州、四川和西藏等省区[2].现代研究表明川续断挥发油对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌能力[3]，并对未孕或妊娠小鼠子宫具有显著的抑制收缩作用，能抑制妊娠小鼠离体子宫的自发收缩频率[4].水蒸气蒸馏法是提取中药挥发油的常用方法之一[5-9].现已报道的川续断挥发油提取方法以乙醚为溶剂进行索氏提取，然后对乙醚提取物进行水蒸气蒸馏，从而提取挥发油[3]；但此方法提取时间较长，且提取率较低.近年来，超声辅助提取法已发展成为提取天然产物中活性成分的重要方法[10].超声波辅助提取方法的操作简单，能缩短提取时间，提高药材成分的提取率，同时在提取过程中温度升高不明显，可抑制有效成分的挥发[11].目前，超声辅助提取川续断挥发油的研究未见报道.本研究采用Box-Benhnken响应面法设计优化超声辅助提取川续断挥发油的最佳工艺参数，回归拟合方程预测模型能对川续断挥发油的超声提取效果进行有效预测和分析，并利用GC-MS分析方法对川续断挥发油化学成分进行解析鉴定，为川续断挥发油的药用研究和开发利用奠定基础.

1 材料与仪器

1.1药材与试剂川续断采自云南省大理州弥渡县，石油醚、无水NaSO4均为分析纯(成都天华化工科技有限公司).

1.2仪器QP2010Plus型气相色谱-质谱联用仪(日本岛津)，瑞士MettlerToledo公司AB104-N型电子分析天平，KQ-100DA型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，R201D-Ⅱ旋转蒸发器(上海申顺生物科技有限公司)，SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，GZX-DH-40X45电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂)，W201D恒温水浴锅(上海申顺生物科技有限公司).

2 实验方法

2.1川续断挥发油提取将干燥后的药材粉碎，过40目筛，再置干燥箱中烘干至恒重.准确称取10g药材粉末于具塞锥形瓶中，加入一定料液比的石油醚，密塞，超声提取一定时间，在提取液中加入无水Na2SO4，进行抽滤，滤液倒入已知质量为m1的圆底烧瓶中，然后在35 ℃水浴锅中减压浓缩至干，称其质量为m2.

挥发油提取率(%)=(m2-m1)/10×100%.

2.2单因素试验

2.2.1超声功率 本文料的单位为g，溶液的单位为mL，以石油醚为提取剂，在料液比1∶15，超声时间30min条件下，设置超声功率分别为60、70、80、90、100W等5个水平，每个水平进行3次平行实验，计算每个水平下挥发油平均得油率.

2.2.2超声时间 以石油醚为提取剂，超声功率为2.2.1中最优水平，料液比为1∶15，设置超声时间分别为10、20、30、40、50min等5个水平，每个水平进行3次平行实验，计算每个水平下挥发油平均得油率.

2.2.3料液比 以石油醚为提取剂，超声功率为2.2.1中最优水平，超声时间为2.2.2中最优水平，设置料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 等5个水平，每个水平进行3次平行实验，计算每个水平下挥发油平均得油率.

2.3Box-Benhnken响应面法试验根据2.2中单因素实验结果，利用Design-Expert8.0.6Trial软件设计超声功率(A)、料液比(B)、超声时间(C)等3因素3水平的Box-Benhnken试验，以得油率为响应值.试验设计见表1.

表 1 响应面分析因素及水平表

2.4GC-MS分析气相色谱条件：色谱柱：Rxi-5m弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：氦气；进样温度：290 ℃；柱箱温度(采用程序升温方案)：柱初始温度为50 ℃，保持5min，以10 ℃/min升至200 ℃，保持2min，再以5 ℃/min升至290 ℃，保持10min；进样量：1μL；分流比：10∶1；柱流量：1.0mL/min；溶剂延迟时间：3min.

质谱条件：离子源：电子轰击离子源(EI)；离子源温度：200 ℃；接口温度：220 ℃；检测电压：0.8kV；质量扫描范围(m/z)：33～700amu；电子能量：70eV.

3 结果与分析

3.1单因素实验

3.1.1超声功率的影响 在超声功率60、70、80、90、100W水平下挥发油平均得油率分别为：1.365%、1.521%、1.868%、1.777%、1.661%.超声波是通过空化效应破碎细胞，从而提取细胞内的挥发油.当超声功率达到一定值时，产生的空化现象使气泡闭合过快，产生的冲击波不能使川续断细胞完全破碎，从而导致得油率下降[12].因此，进行响应曲面分析试验时，超声功率以80W为中心值.随着超声功率的增大，川续断的得油率不断升高，当超声功率为80W时，此时得油率达到最大值，随着超声功率继续增大，得油率略有降低.

3.1.2料液比的影响 在料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25水平下挥发油平均得油率分别为:1.251%、1.356%、1.851%、1.799%、1.8%.当料液比为1∶15时，川续断挥发油得油率达到最大值.料液比小于1∶15时，随着料液比的增大，得油率也随之上升.当料液比达到1∶15时，得油率基本持平，随着溶剂剂量的增加，得油率几乎保持稳定.从节约溶剂的方面考虑，进行响应曲面分析试验时，料液比以1∶15为中心值.

3.1.3超声时间的影响 在超声时间10、20、30、40、50min水平下挥发油平均得油率分别为：1.431%、1.46%、1.836%、1.709%、1.65%.当超声时间达到30min时，此时得油率达到最大值，随着超声时间的继续延长，得油率稍微下降.推断其原因为随着超声时间的延长，导致部分挥发油结构遭到破坏，从而使部分挥发油成分发生降解，使得川续断挥发油提取率降低.因此，进行响应曲面分析试验时，超声时间以30min为中心值.

3.2响应面优化试验

3.2.1响应面设计方案 根据Design-Expert8.0.6Trial软件中Box-Behnken设计响应曲面试验,以A、B、C等3个因素为变量，以得油率为响应值，实验设计和结果见表2.

3.2.2响应面法试验结果分析 根据Design-Expert8.0.6Trial软件分析数据得回归拟合方程

得油率=-13.642+0.316×A+0.239×B+
0.080×C+2.39×10-3×AB-4.45×10-4×
AC+2.50×10-4×BC-2.16×10-3×A2-
0.014 3×B2-7.42×10-4×C2.

试验结果显著性和方差分析见表3,该模型F=121.54，P<0.000 1，可知该二次回归拟合方程模型极显著.该模型中A、B、C、AB、A2、B2、C2项是极显著(P<0.01)，AC项是显著(P<0.05)，BC项是不显著(P<0.1).通过F值分析，3因素对得油率的影响大小依次为：A(F=44.76)>B(F=22.32)>C(F=13.46).失拟项值为6.52，P=0.050 9>0.05，表明失拟项不显著，实验误差较小，因此该模型能对川续断挥发油的超声提取效果进行有效预测和分析.

表 2 Box-Benhnken响应面实验设计和结果

表 3 试验结果显著性和方差分析表

注： **表示影响极显著(P<0.01)， *表示影响显著(P<0.05)，P<0.1是不显著项.

实验数据做概率与预测分析，如图1和图2所示.图1数据点几乎分布在一条直线上，符合对残差正态概率的要求；图2中数据点分布杂乱无章、无规律，符合残差与预测值的要求，说明该组实验数据正常，可以反映实验的真实性.从表4知，模型的相关系数R2=0.993 6，表明该模型有较好拟合度；修正R2=0.985 5，表明该模型可以解释98.55%的实验数据变异性；预测R2= 0.913 8，与R2、修正R2相差不大，表明该模型预测值与实测值符合良好，模型具有代表性.得油率的平均值(δMean)为1.53，标准偏差(σ)和变异系数(C×V)均表示数据的离散程度：

图 1 残差的正态概率分布图

项目参数项目参数σ0029R209936δMean153修正R209855C·V190预测R209138

C·V=(σ/δMean)× 100%，

C·V<15，表示实验数据正常.

以得油率为响应值作响应曲面图，如图3～5所示，并分析各个因素间的显著性和交互作用.从图3可知，当超声时间固定在零水平时，超声功率和料液比的响应曲面最陡，说明两者对川续断挥发油提取率影响最显著，且成二次线性关系；底部等高线呈椭圆且闭合，说明两者交互作用显著，且有最高点.从图4可知，当超声功率固定在零水平时，料液比响应曲面较陡，但是超声时间响应曲面比较缓和，几乎成一条直线，说明料液比对川续断挥发油提取率更显著，且成二次线性关系，但是超声时间对川续断挥发油提取率影响显著性较差，几乎呈一次线性关系.从图5可知，当料液比固定在零水平时，超声功率响应面较陡，但是超声时间响应曲面比较缓和，相比较来说超声功率对川续断挥发油提取率影响更显著.通过响应曲面图分析可知3个因素对川续断挥发油提取率影响性大小为：A>B>C.

图 3 超声功率和料液比对川续断挥发油得油率响应曲面和等高线

图 4 料液比和超声时间对川续断挥发油得油率响应曲面和等高线

图 5 超声功率和超声时间对川续断挥发油得油率响应曲面和等高线

通过Design-Expert 8.0.6 Trial软件分析可确定最佳工艺条件为：超声功率78.19 W,料液比1∶15.22,超声时间33.16 min，得油率预测值为1.846%.

3.2.3模型验证 针对实际可操作性，工艺条件修改为：超声功率80W,料液比1∶15,超声时间33min.在此条件下，通过3次平行实验进行验证，平均得油率实测值为1.869%，与预测值基本一致(预测值与实测值对比如图6所示).从图6可见，数据点基本上处于一条直线上，拟合方程模型的预测值与实测值差异较小，可以用于挥发油得油率预测.因此，结果表明该拟合方程模型的预测值与实测值符合良好，能有效的预测川续断挥发油得油率，对川续断挥发油的提取和优化具有指导意义.

图 6 预测值与实测值对比图

3.3GC-MS分析按本文2.4的条件和方法对川续断挥发油成分进行GC-MS分析，得到挥发油成分的总离子流图，计算机通过峰面积归一化法对总离子流图进行解析，共检测出53种成分，通过质谱谱库NIST08.LIB检索以及人工图谱解析鉴定了51种化合物(表5).川续断挥发油中峰面积百分比最高的物质为γ-谷甾醇(35.80%)，其次为豆甾醇(8.37%)、24-甲基-5-胆甾烯-3-醇(7.06%)、羊毛甾醇(6.71%)、正十五酸(3.23%)、正四十四烷(3.13%)、4α,14-二甲基-9β,19-环-5α-麦角甾-24(28)-烯-3β-醇乙酸酯(3.00%)、4-胆甾烯-3β-醇(2.29%)、羽扁豆醇(2.27%)、四十三烷(2.10%)、Z-7-十四碳烯醛(2.09%)、熊果-12-烯-28-醛(2.07%)、11,14-二十碳二烯酸甲酯(1.96%)、正二十一烷(1.96%)、2,6,10,15-四甲基十七烷(1.92%)、11-癸基二十四烷(1.74%)、溴化金合欢酯(1.62%)、1-氯二十七烷(1.11%)、1-氯二十碳烷(1.08%).

续表5

峰号保留时间/min名称分子式相对分子质量峰面积百分比/%3440215法呢醇C15H26O2220763541178正四十四烷C44H906183133642874正二十一烷C21H442961963744853四十三烷C43H886042103845044棕榈酸-3-溴-2-丙炔酯C19H33BrO23720933945512胆甾烯基豆蔻酸酯C41H72O259607440472031-氯二十七烷C27H55Cl414111414879724-甲基-5-胆甾烯-3-醇C28H48O4007064249699豆甾醇C29H48O41283743499981-碘四十八烷C48H97I8000814451493γ-谷甾醇C29H50O41435804551951溴化金合欢酯C15H25Br28416246523494α，14-二甲基-9β，19-环-5α-麦角甾-24(28)-烯-3β-醇乙酸酯C32H52O246830047527881-氯二十碳烷C20H41Cl3161084853693羊毛甾醇C30H50O42667149551484-胆甾烯-3β-醇C32H52O24682295056321羽扁豆醇C30H50O4262275161751熊果-12-烯-28-醛C30H48O424207

4 结论

本研究采用Box-Benhnken响应面法设计优化超声辅助提取川续断挥发油的最佳工艺参数，回归拟合方程预测模型能对川续断挥发油的超声提取效果进行有效预测和分析，超声辅助提取川续断挥发油的最佳工艺参数为：超声功率80 W,料液比1∶15,超声时间33 min.模型验证实验平均得油率实测值为1.869%，与预测值1.846%基本一致，表明该实验方法具有可行性，分析结果可靠，为川续断挥发油工业化提取提供理论依据.

通过GC-MS分析超声辅助提取得到的挥发油，共检测到53种成分，并鉴定出51种化合物，鉴定率为96.23%.其中醇类的相对含量最大，烃类物质种类最多，相对含量较大的化学成分是γ-谷甾醇(35.80%)，其次为豆甾醇(8.37%)、24-甲基-5-胆甾烯-3-醇(7.06%)、羊毛甾醇(6.71%)等.其中，γ-谷甾醇是β-谷甾醇的C24位异构体，具有降血糖作用和抗癌活性[13]；豆甾醇具有抗肿瘤、降低血液胆固醇、抗氧化、抗炎和对学习记忆的改善等药理作用[14]；羊毛甾醇可以逆转晶状体内蛋白质的聚集，减轻白内障的严重程度，提高晶状体的清晰度[15].

[1] 中华人民共和国国家药典委员会. 中国药典[S]. 北京：中国医药科技出版社，2015：329.

[2] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志:第73卷[M]. 北京：科学出版社，1986：63.

[3] 吴知行，周胜辉，杨尚军. 川续断中挥发油的分析[J]. 中国药科大学学报，1994，25(4)：202-204.

[4] 龚小健，吴知行，陈真，等. 川续断对离体子宫的作用[J]. 中国药科大学学报，1995，26(2)：115-119.

[5] 李涛，汪元娇. GC-MS法分析短葶飞蓬挥发油中的化学成分[J]. 华西药学杂志，2017，32(3)：287-288.

[6] 李涛，何璇. GC-MS测定野生当归挥发油中的化学成分[J]. 华西药学杂志，2015，30(2)：249-250.

[7] 李涛，张浩. GC-MS分析两种提取方法对川产大花红景天挥发油的影响[J]. 华西药学杂志，2010，25(4):389-391.

[8] 李涛，张浩. GC-MS分析四川产长鞭红景天挥发油的化学成分[J]. 华西药学杂志，2008，23(2):176-177.

[9] 李涛，王天志. 藏药加哇挥发油化学成分研究[J]. 中草药，2001，32(9)：780-781.

[10] 潘红亮，欧阳天贽. 水蒸气蒸馏法和超声辅助提取法提取华细辛挥发油的比较[J]. 食品科学，2011，32(10)：190-193.

[11] 何颖. 中药挥发油提取方法分析[J]. 天津药学，2015，27(1)：47-50.

[12] 张国栋，严科丹，胡博然. 超声波辅助提取薄荷挥发油的工艺优化[J]. 农产品加工(学刊)，2013(8)：44-46.

[13] 熊汝琴，王锐，陈顺芳，等. 不同产地红天麻挥发性成分分析[J]. 湖北农业科学，2014，53(17)：4167-4169.

[14] 周志远，卢群，刘洋，等. 豆甾醇的研究及开发进展[J]. 中国当代医药，2015，22(24)：15-17.

[15] ZHAO L, CHEN X J, ZHU J, et al. Lanosterol reverses protein aggregation in cataract[J]. Nature，2015，523(7562)：607-611.