蒙古黄芪多糖含量测定的方法学研究

陈虎虎

（陇东学院岐伯医学院，甘肃 庆阳 745000）

1 仪器及试药

UV1601分光光度计（日本岛津）、AB204-N电子分析天平（METTLER TOLEDO）、电热恒温水浴锅（奥特宝恩斯仪器有限公司）、旋转蒸发仪（无锡市星海王生化设备有限公司；D-无水葡萄糖对照品（批号：0833-9501中国药品生物制品检定所）、甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 多糖含量测定方法建立

照紫外-可见分光光度法《中国药典》（2010版一部附录VA）测定[1]。

2.1 对照品溶液的制备：精密称取无水葡萄糖对照品适量，加水制成每1 mL含0.5 mg的溶液，摇匀，即得。

2.2 标准曲线的制备：分别精密量取对照品溶液1.0 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、4.0 mL、4.5 mL、5.0 mL，置5 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取上述各溶液1 mL，置10 mL具塞试管中，精密加入5%苯酚溶液0.6 mL，混匀，迅速加入80%硫酸3.0 mL，摇匀，于90 ℃水浴中加热15 min，取出，放入冰浴中冷却15 min，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在490 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.3 供试品溶液的制备[2-3]：取60 ℃干燥至恒重的蒙古黄芪药材粉末（过60目筛）2.5 g，精密称定，置索氏提取器中，用80%乙醇索氏回流提取2 h，残渣挥干溶剂后，加水80 mL回流提取2次，每次1.5 h，滤过，取滤液，用适量水洗涤药渣，合并至200 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置10 mL具塞干燥试管中，备用。

2.4 测定法：精密量取供试品溶液1 mL，置10 mL具塞试管中，照标准曲线的制备项下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液0.6 mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含葡萄糖的重量（mg），计算，即得。

结果表明，该色谱条件下对照品和供试品吸光度值稳定，阴性对照品在相应吸收波长下无干扰，该色谱条件专属性良好。

2.5 供试品的制备方法考察：在供试品溶液制备过程中对不同提取方法进行比较：

2.5.1 醇除杂：取60 ℃干燥至恒重的蒙古黄芪药材粉末（过60目筛）2.5 g，精密称定，置索氏提取器中，用80%乙醇索氏回流提取2 h，取80%乙醇索氏提取液，蒸干，残渣用适量水溶解，滤过至10 mL量瓶中，并稀释至刻度，精密量取滤过液1 mL，置10 mL具塞干燥试管中，备用。按上述“2.4”中测定法测定，吸光度值为0，表明该除杂方法可行。

2.5.2 提取

2.5.2.1 提取次数考察：取60 ℃干燥至恒重的蒙古黄芪药材粉末2.5 g，精密称定，置索氏提取器中，用80%乙醇索氏回流提取2 h，残渣挥干溶剂后，加水100 mL回流提取，每次1.5 h，滤过，取滤液，用适量水洗涤药渣，合并至200 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取滤过液1 mL，置10 mL具塞干燥试管中，备用，结果提取2次后可将蒙古黄芪中多糖提取完全。

2.5.2.2 提取时间考察：取60 ℃干燥至恒重的蒙古黄芪药材粉末3份，每份2.5 g，精密称定，置索氏提取器中，用80%乙醇索氏回流提取2 h，残渣挥干溶剂后，分别加水100 mL回流提取1.0 h、1.5 h、2.0 h各2次，滤过，取滤液，用适量水洗涤药渣，合并至200 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取滤过液1 mL，置10 mL具塞干燥试管中，备用。按上述“2.4”中测定法测定，结果表明每次提取1.5h与2.0h相比较，多糖含量增加并不明显，从节约成本及时间角度考虑，每次提取1.5 h即可满足实验要求。

2.5.2.3 溶剂用量考察：取60 ℃干燥至恒重的蒙古黄芪药材粉末3份，每份2.5 g，精密称定，置索氏提取器中，用80%乙醇索氏回流提取2 h，残渣挥干溶剂后，分别加水50 mL、80 mL、100 mL回流提取2次，每次1.5 h，滤过，每次滤液减压浓缩（0.1 MPa，60 ℃），浓缩液转移至200 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取滤过液1 mL，置10 mL具塞干燥试管中，备用。按上述“2.4”中测定法测定，结果表明：以80 mL溶剂提取与100 mL溶剂提取相比，增加溶剂量多糖含量并无明显变化，所以用水80 mL提取即可。

2.6 供试品溶液的制备方法确定：取60 ℃干燥至恒重的蒙古黄芪药材粉末（过60目筛）2.5 g，精密称定，置索氏提取器中，用80%乙醇索氏回流提取2 h，残渣挥干溶剂后，加水80 mL回流提取2次，每次1.5 h，滤过，取滤液，用适量水洗涤药渣，合并至200 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置10 mL具塞干燥试管中，备用。

3 多糖含量测定方法学研究

3.1 标准曲线的绘制：精密量取葡萄糖对照品溶液（0.493 mg/mL）1.0 mL，2.0 mL，2.5 mL，3.0 mL，4.0 mL，5.0 mL分别置5 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取上述各溶液1 mL，置10 mL具塞试管中，精密加入5%苯酚溶液0.6 mL，混匀，迅速加入80%硫酸3.0 mL，摇匀，于90 ℃水浴中加热15 min，取出，放入冰浴中冷却15 min，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在490 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果见表1。

表1 标准曲线测定结果

以对照品质量为横坐标，UV数值为纵坐标作图，得标准曲线，见图2。

图2 葡萄糖标准曲线

结果表明，在对照品质量为98.52～494.60 μg，呈良好的线性关系。回归方程为：y=0.0011x+0.0276，相关系数：r=0.9991。

3.2 精密度试验：取供试品溶液，依法处理，连续测定6次，记录多糖吸光度值，结果表明，本试验中供试品吸光度值RSD为0.46%，精密度良好。

4 讨 论

蒙古黄芪多糖药理作用明显，在蒙古黄芪的质量研究中有必要对其加以关注；本实验采用单因素试验比较了不同提取溶剂、提取方法和提取时间对多糖含量的影响，确定出最佳前处理方案并建立了紫外分光光度法测定蒙古黄芪多糖含量的方法；对其方法学进行研究，结果表明该含量测定方法稳定可行，受蛋白质等物质影响较小，能方便、快捷、准确的检测样品中多糖的含量，能够对蒙古黄芪中总多糖含量进行控制。

[1] 董群,郑丽伊,方积年.改良的苯酚-硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究[J].中国药学杂志,1996,31(9):550-553.

[2] 许会生,赵广荣,张铁军等.当归多糖的提取分离研究进展[J].江西科学,2007,25(1):42-46.

[3] 肖培根,杨世林,赵永华,等.黄芪[M].北京:中国中医药出版社,2001:123-124.