肺癌相关基质金属蛋白酶研究进展

吴伟东，罗磊，丁锋

(暨南大学医学院附属广州市红十字会医院，广州 510220)

肺癌是全世界男性和女性癌症相关死亡的主要原因[1]。从生物和临床角度来看，肺癌是一种具有多种组织学亚型的异质性疾病，其中非小细胞肺癌(NSCLC)最常见。传统上，NSCLC已经被用来表示具有不同于小细胞癌(SCLC)的组织学和细胞学特征的肿瘤。大多数NSCLC可以分为三大类：大细胞癌、鳞状细胞癌及腺癌。然而，还有其他较少诊断的组织学类型。50%以上的典型NSCLC病例被诊断时已是晚期[2]，对于大多数NSCLC患者，化疗为其主要治疗方法但预后仍然很差[2]。基质金属蛋白酶(MMPs)在肺癌发病机制中的作用及进一步鉴定相关新型治疗靶标可能有助于肺癌患者的早期检测和生存改善。

1 MMPs的生物学功能

1.1 结构与分类 截至目前，已经鉴定出人类MMP家族成员中23种不同的金属蛋白酶成分[3]。与MMP-1序列同源性一样，大多数proMMPs结构中含有半胱氨酸转化基序PRCGXPD来维持其酶原形式。每种MMPs催化结构域中的锌结合基序HEXGHXXGXXH决定其结合相关蛋白酶的种类。对于底物与某些MMPs的特异性结合，MMPs具有几个S亚位，Zn2+的右侧激发的S1′、S2′和S3′和Zn2+的左侧未激发的S1、S2、S3，以及其催化位点的Zn2+本身。其中，S1′口袋是最关键的识别位点，在不同的MMP中S1′口袋所含氨基酸序列和深度不一。对于所有MMP，P1′-S1′相互作用是决定底物切割位置的关键因素(P1′是底物与酶的S1′口袋结合的基团)；然而MMP-23除外，因其缺乏半胱氨酸转换基序，但其催化结构域的氨基酸序列与MMP-1有关。MMP通常由前结构域、催化结构域、铰链区和血红蛋白结合域四大块组成。它们从细胞分泌或锚定到质膜。基于MMPs序列相似性、结构域组织差异性和底物特异性，MMPs可分为胶原酶：MMP-1、-8、-13、-18；明胶酶：MMP-2、-9；基质降解酶：MMP-3、-10、-11；膜型MMP：MMP-14、-15、-16、-24、-17、-25；Matrilysins:MMP-7、-26；其他MMPs：MMP-12、-19、-20、-21、-23、-27、-28。

1.2 MMPs活性的调控机制及功能 MMPs的活性调节机制于多个水平严格调控，包括基因表达、酶原激活、区室化和活性酶的抑制[4]。大多数MMP的表达在转录水平上受各种生理诱发因子包括激素、生长因子、细胞因子、细胞-细胞相互作用、细胞-细胞外基质相互作用及部分相关肿瘤启动子等调节[5]。proMMPs细胞内激活时需要破坏前结构域中保守的半胱氨酸残基的硫醇与催化位点中的锌离子之间的共价键，阻断底物结合裂口。在细胞外活化期间，半胱氨酸转换可以通过自溶或其他蛋白酶如纤溶酶、胰蛋白酶、弗林蛋白酶和其他MMPs来激活。此外，半胱氨酸转换可以通过活性氧氧化半胱氨酸或被含汞化合物人为地破坏，导致前结构域的变构重新定位及自溶裂解[6]。另外，MMPs特异性和活性可以通过某些胞内或胞外局部空间位置差异分隔来控制，可能与糖胺聚糖的相互作用有关[7]。激活后的MMPs可分解成一种或多种细胞外基质成分，且不同MMPs之间亦能相互激活。活化后的MMPs，通过蛋白酶抑制剂如α2-巨球蛋白及其特异性抑制剂即金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)直接抑制。MMPs的活性主要受到内源性抑制剂TIMPs直接抑制，该家族由四种作为糖基化或非糖基化形式存在的蛋白酶抑制剂TIMP 1～4组成。TIMP是21～29 kDa的蛋白质，其具有由125个氨基酸组成的N-末端结构域和由65个氨基酸组成的C-末端结构域，两末端结构域均含3个二硫键，其中N末端结构域作为单独单位折叠并与MMPs的催化结构域之间存在紧密联系。然而，在某些情况下，C末端结构域可以进一步增强MMP/TIMP相互作用。此外，TIMP可以与明胶酶酶原相互形成复合物，这表明其C-末端结构域与血红蛋白样结构域存在相互作用。分泌形成的TIMPs可以与多种膜锚定或分泌的MMP相互作用[8]。以1∶1结合MMP的活性位点形成抑制复合物，并且抑制所有MMP的活性。TIMPs在体内不同组织差异分布反映其基因表达特异性，其被单独调节。TIMPs中除了TIMP-3与细胞外基质隔离外，其余均以可溶形式存在。在结构上，TIMP由两个并排的结构域组成，每个域由3个内部二硫键稳定化[9]。其N末端为抑制性结构域，有时被称为“抑制结构域”。然而，Batra等[9]研究发现，除了此两个抑制结构域单独作用外，完整TIMP的MMP复合物中，相互抑制作用可增加一个数量级。四种人TIMPs具有广泛的重叠特异性，且每一种TIMP可抑制大多数MMPs，但相互之间亲和力谱跨越多个数量级。其中TIMP-2/MMP-2和TIMP-1/MMP-9的相互作用不仅涉及MMP催化结构域，而且还涉及与类血红素结构域的相互作用。除了TIMP外，α2-巨球蛋白和受体介导的内吞也可以防止活化的MMPs发挥其作用。体内局部组织中proMMPs、活性MMPs及TIMPs之间的平衡决定了MMPs的整体活动。控制相应部位生理、病理过程及信号事件，如细胞的生长和分化、细胞迁移与侵袭、细胞成活及凋亡、局部血管生成等。

胶原酶的特征为它们能够在N端的四分之三的特定位点切割间质胶原Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。胶原酶也可以消化许多其他细胞外基质和非细胞外基质分子。明胶酶的催化结构域含有三个重复的Ⅱ型纤连蛋白结构，其可结合胶原、明胶和层粘连蛋白，降解变性的胶原蛋白和明胶。其中仅MMP-2可降解Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原。基质降解酶可以消化各种基质，如明胶、纤连蛋白、核酸、层粘连蛋白、腱生蛋白、玻连蛋白、核心蛋白聚糖以及蛋白聚糖。基质降解酶中MMP-3、-10具有相似的底物特性，但MMP-3的蛋白水解效率更高。除了降解细胞外基质组分外，MMP-3同时可激活多种proMMPs，其在部分加工的proMMP-1成为完全活性的MMP-1的生化过程中起着至关重要的作用。Matrilysins特征在于缺乏血红蛋白结合域。MMP-7、MMP-26也被称为endometase。其中MMP-26具有更多的底物特异性限制。Matrilysins除可降解细胞外基质组分外，MMP-7还可以处理细胞表面分子，如前-防御素、As配体、前肿瘤坏死因子-α和E-钙黏蛋白。在四种膜型MMP中，MMP-14和-15具有大量重叠的底物特异性，包括天然原纤维胶原、明胶、纤连蛋白和玻连蛋白。其中MMP-17和MMP-25是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白，可通过GPI锚定点与细胞膜连接进而切割Ⅳ型胶原、明胶、纤连蛋白和层粘连蛋白[10]。膜型基质金属蛋白酶1(MT1-MMP)在血管生成中起重要作用。MT5-MMP是脑特异性的，主要在小脑中表达。MT6-MMP(MMP-25)仅在外周血白细胞和间变性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤中表达，但不在脑膜瘤中表达。其他MMPs中金属弹性蛋白酶(MMP-12)主要在巨噬细胞表达，是巨噬细胞迁移所必需的。消化朊蛋白酶的Elylysin(MMP-20)主要位于新形成的牙釉质内。缺陷性牙釉质遗传性疾病，是由于MMP-20切割位点的突变引起的。MMP-23也称为半胱氨酸阵列MMP，主要在生殖组织中表达。MMP-28，主要在角质形成细胞中表达。完整和损伤的皮肤中的表达模式表明MMP-28可能在组织止血和伤口修复中起作用。MMP-22首先从鸡成纤维细胞中发现，这种酶的功能未知。Khokha等[11]发现，MMPs细胞表面受体的胞外域脱落影响细胞膜的表面组成和细胞对胞外信号的反应性。鉴于MMPs的多重效应，可以推测其在不同的生理和病理生理条件下发挥重要作用。

2 与肺癌相关MMPs

2.1 MMP14(MT1-MMP) 在各种膜型基质金属蛋白酶中，MMP14是惟一一种可以降解胶原Ⅰ的模型MMP,因此在通过细胞外基质的细胞迁移中起着关键作用。研究证实，MMP14无效小鼠模型实验中，小鼠发生异常，于4周后死亡，表明MMP14不可或缺性及不可代替性。多种人类肿瘤中MMP14均存在上调。MMP14通过类血红素结构域结构域识别水解底物，类血红素结构域的二聚化显著增加MMP14的活性，其可切割并激活proMMP2和proMMP13，促进细胞外基质蛋白水解，进一步促进肿瘤细胞迁移、侵袭和转移扩散。Stawowczyk等[12]研究发现，在原位Kras驱动的NSCLC小鼠模型(K-ras LSL-G12D/+ ; p53 flox/flox)中发现，MMP14在肿瘤内骨髓细胞和EpCam+肿瘤细胞中均上调。定量RT-PCR分析和Western印迹证实在肿瘤内髓系细胞和上皮间隔区MMP14表达增加。肺切片的免疫荧光染色显示，在肿瘤中的上皮细胞和造血基质细胞中都检测到膜特异性MMP14表达。在NSCLC患者肿瘤组织中也观察到MMP-14异常升高，与邻近非肿瘤组织相比，MMP14在CD11b+、CD33+单核细胞，CD11b+、CD33-中性粒细胞及EpCAM+上皮细胞中特异性上调。用DN-MMP14阻断MMP14的功能，可能由于其降解胶原蛋白Ⅰ功能受损，致使细胞外基质降解能力减弱，阻断肿瘤细胞的侵袭过程。小鼠模型中显示MMP14表达阴性的HKP1肺肿瘤细胞生长受抑制，表明MMP14可能在NSCLC进展中起关键作用。后期可以更加深入研究MMP-14在NSCLC中的作用及开发MMP-14抑制剂，改善NSCLC患者的治疗效果。

2.2 MMP-10 MMP-10与其他两种基质降解酶(MMP-3、-11)存在较大差异。虽然MMP-10在结构和底物特异性方面与MMP-3密切相关，但诱导能力、活性和细胞分布迥然不同。MMP-10具有相对宽的底物特异性，包括proMMP、细胞外基质组分、蛋白聚糖、糖蛋白和胶原。与其他几种MMPs主要位于肿瘤基质不同，主要表达于肿瘤细胞。MMP-10的过表达已经在上皮起源的几种人类肿瘤中得到证实，包括头颈部、食管和口腔鳞状细胞癌以及皮肤鳞状细胞癌和基底细胞癌。Gill等[13]通过对甲醛固定及石蜡包埋的NSCLC标本、NSCLC新鲜切除标本和组织学正常的早期肺癌癌旁组织分析发现，大多数组织学正常肺组织切片中MMP-10低表达，NSCLC组织学类型中MMP-10呈高水平表达。但不同等级的NSCLC组织MMP-10表达无明显差异性。在腺癌、大细胞癌和鳞状细胞癌中MMP-10表达异常升高，但相互之间差异无统计学意义，且与淋巴结转移无相关性。早期在上皮性皮肤癌研究中发现，仅在层粘连蛋白-5(Ln-5)阳性肿瘤细胞中观察到MMP-10的表达，且与之前伤口愈合研究一致。表明这两种蛋白存在紧密联系。Ln-5在肺腺癌中亦过表达，与血管侵袭、复发和预后不良相关，其过表达发生在肺肿瘤形成相对早期阶段，与淋巴管侵袭或转移无关。假设MMP-10为肺肿瘤形成早期事件，则涉及肿瘤生长而非侵袭，并与预后不良相关联。一项小型研究(6例病例)证实人类NSCLC手术切除后复发中MMP-10 mRNA水平升高(5例)[14]，提示MMP-10在NSCLC发展中的存在潜在作用。基于MMP-10在人类肿瘤中的表达谱，加上广泛底物特异性和致瘤过程不同阶段的表达差异，表明MMP-10是潜在的肿瘤标志物，或许可预测临床行为，使特异性抑制剂或靶向治疗剂靶向MMP-10治疗NSCLC成为一种可能性。

2.3 MMP-2、MMP-9 在MMPs中，MMP-2(明胶酶A)和MMP-9(明胶酶B)在胶原蛋白降解中尤其重要，通过胶原酶裂解原纤维胶原三重螺旋结构使胶原蛋白变性失活。MMP-2、-9对天然Ⅳ型和Ⅴ型胶原蛋白、蛋白聚糖、弹性蛋白和纤连蛋白也具有强活性。研究发现，其在肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用。后期研究发现，生长因子如血管内皮生长因子被隔离在细胞外基质中可以通过MMP-9介导的蛋白水解而激活。MMP-2、-9也可激活一些非矩阵相关底物，如生长因子7、9，细胞因子，趋化因子等。以往在MMP-9缺陷KO小鼠模型中表现出特征性的胚胎表型，其特征在于长骨中生长板的血管化和骨化的延迟。实验中MMP-9缺陷小鼠中肿瘤细胞转移能力减弱。Masson等[15]将恶性角质形成细胞移植到MMP-2-/-，MMP-9-/-和双重MMP-2-/-MMP-9-/-小鼠模型中发现，MMP-2和MMP-9的组合缺乏会损害肿瘤侵袭和血管形成。移植到MMP-2-/-，MMP-9-/-小鼠中的肿瘤细胞招募血管发生,并以野生型小鼠观察到的相似程度渗入宿主组织。当恶性细胞移植到双重MMP-2-/-MMP-9-/-小鼠时，宿主衍生的血管不能向肿瘤细胞层迁移，受阻于胶原凝胶层下。Li等[16]研究发现，MMP-2、MMP-13在大细胞肺癌肿瘤血管生成模拟(VM)中具有重要作用。由MMP-2切割的Ln-5片段在三维培养物中通过大细胞肺癌细胞系H460和H661促进管状结构形成。用MMP-2切割的Ln-5片段处理的细胞高表达表皮生长因子受体(EGFR)和F-肌动蛋白，而MMP-13的瞬时上调或用重组MMP-13蛋白处理在3D培养中消除H460细胞的管状结构形成；同时由MMP-13切割的Ln-5片段降低EGFR/F-肌动蛋白表达并破坏VM形成。MMP-13与大细胞肺癌组织中的VM、Ln-5和EGFR呈负相关。总之，MMP-2或MMP-13可通过切割Ln-5来影响EGFR信号激活，进而促进或破坏大细胞肺癌中的VM形成。

2.4 MMP-13 胶原酶中的MMP-13可以降解细胞外基质中的原纤维胶原蛋白，其在正常组织中表达极低。最早在乳腺癌中发现,后来在关节炎、动脉粥样硬化等许多病理状况下观察到异常表达。已有研究报道，MMP-13在头颈部鳞状细胞癌、食道癌、胃癌、结肠直肠癌及皮肤癌症中过表达。在颈部鳞状细胞癌、泌尿道或皮肤癌中观察到，MMP-13不仅表达于肿瘤细胞本身，在其周围基质细胞中亦过表达，特别是侵袭前基质中。提示MMP-13可能在介导细胞侵袭所需早期信号事件中发挥重要作用。Mathieu等[17]通过小鼠K-ras LSL-G12D肺癌模型研究MMP-13在整个肺肿瘤发生过程中(AAHs肺异种腺瘤性增生，腺瘤和腺癌)的表达情况。在K-ras LSL-G12D小鼠模型中使用MMP特异性荧光探针和双重MRI-FMT成像系统检测，结果显示活体小鼠肺癌组织中MMPs高表达。同时通过人肺肿瘤分析证实，与非侵入性病变相比，人肺腺癌MMP-13的免疫组织化学染色显示侵袭性和微创性腺癌中MMP-13表达显著增加。表明MMP-13在肺腺癌发生中的重要性，提示MMP-13的表达可作为肺腺癌进展的潜在标志物，对后期用于早期诊断的特异荧光智能探针及肺腺癌的治疗开辟了新径。

3 MMPs的人工合成抑制剂

研究显示,MMPs在各种疾病(特别是肿瘤激活，生长，侵袭过程中)病理生理过程中起关键作用。因此MMPs可成为特异治疗靶点。TIMPs为MMPs的天然组织抑制剂，有助于维持细胞外基质的动态平衡。然而，由于体内半衰期短，TIMPs不适合药理学直接应用。迄今为止，大量人工合成MMP抑制剂在实验模型中显示出一定效果。在有关肺癌小鼠模型中使用肽模拟/非肽模拟抑制剂后，肿瘤生长及侵袭明显受抑制，但肌肉、骨骼等毒性作用明显，且对肺癌晚期小鼠并无效果。但在人类的Ⅲ期临床试验中测试的几代合成的MMP抑制剂，包括肽模拟物(巴马司他)、非肽模拟抑制剂(BAY12-9566，stationmaster，BMS-275291和CGS27023A)和四环素衍生物，并未取得很好的预期效果。部分原因可能是临床试验(比如试验设计欠佳及临床终点不足)和药物本身(如代谢不稳定，口服生物利用度低，抑制特异性差和副作用不良)的问题。在未来研究中或许可以通过使用基因谱及组织微阵列来区分每种MMP的具体作用及位点，通过荧光智能探针体内成像技术评估MMP抑制剂在癌症进展的治疗效果及其活性，使TIMPs成为可行高效的靶向治疗途径。

参考文献：

[1] Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J]. Int J Cancer, 2015,136(5):359-386.

[2] Bordi P, Del Re M, Danesi R, et al. Circulating DNA in diagnosis and monitoring EGFR gene mutations in advanced non-small cell lung cancer[J]. Transl Lung Cancer Res, 2015,4(5):584-597.

[3] Khokha R, Murthy A, Weiss A. Metalloproteinases and their natural inhibitors in inflammation and immunity[J]. Nat Rev Immunol, 2013,13(9):649-665.

[4] Ra HJ, Parks WC. Control of matrix metalloproteinase catalytic activity[J]. Matrix Biol, 2007,26(8):587-596.

[5] Firestein GS, Budd RC, Harris ED Jr, et al. Kelly′s Texbook of Rheumatology[M]. 8th edn. Philadelphia: Saunders Elsevier, 2009:115-134.

[6] Klein T, Bischoff R. Physiology and pathophysiology of matrix metalloproteases[J]. Amino Acids, 2011,41(2):271-290.

[7] Tocchi A, Parks WC. Functional interactions between matrix metalloproteinases and glycosaminoglycans[J]. FEBS J, 2013,280(10):2332-2341.

[8] Jackson HW, Defamie V, Waterhouse P, et al. TIMPs: versatile extracellular regulators in cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2017(1):38-53.

[9] Batra J, Soares AS, Mehner C, et al. Matrix metalloproteinase-10/TIMP-2 structure and analyses define conserved core interactions and diverse exosite interactions in MMP/TIMP complexes[J]. PLoS One, 2013,8(9):e75836.

[10] Nissinen L, Kahari VM. Matrix metalloproteinases in inflammation[J]. Biochim Biophys Acta, 2014,1840(8):2571-2580.

[11] Khokha R, Murthy A, Weiss A. Metalloproteinases and their natural inhibitors in inflammation and immunity[J]. Nat Rev Immunol, 2013,13(9):649-665.

[12] Stawowczyk M, Wellenstein MD, Lee SB， et al. Matrix Metalloproteinase 14 promotes lung cancer by cleavage of Heparin-Binding EGF-like Growth Factor[J]. Neoplasia, 2017,19(2):55-64.

[13] Gill JH, Kirwan IG, Seargent JM, et al.MMP-10 is overexpressed, proteolytically active, and a potential target for therapeutic intervention in human lung carcinomas[J]. Neoplasia, 2004,6(6):777-785.

[14] Cho NH, Hong KP, Hong SH, et al. MMP expression profiling in recurred stage ⅠB lung cancer[J]. Oncogene, 2003,23(3):845-851.

[15] Masson V, de la Ballina LR, Munaut C, et al. Contribution of host MMP-2 and MMP-9 to promote tumor vascularization and invasion of malignant keratinocytes[J]. FASEB J, 2005,19(2): 234-236.

[16] Li Y, Sun B, Zhao X, et al. MMP-2 and MMP-13 affect vasculogenic mimicry formation in large cell lung cancer[J]. J Cell Mol Med, 2017,21(12):3741-3751.

[17] Mathieu S, Jing P, Harvey H, et al. MMP-13 in-vivo molecular imaging reveals early expression in lung adenocarcinoma[J]. PLoS One, 2015,10(7):e0132960.