木香烃内酯诱导卵巢癌细胞凋亡机制研究

石小燕，刘 嵘

(1. 湖北职业技术学院医学分院,湖北 孝感 432000；2. 华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北 武汉 430030)

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤，严重威胁女性的健康，其发病率在女性生殖系统肿瘤中占第3位，但是卵巢癌患者病死率居妇科恶性肿瘤之首[1]。目前卵巢癌主要治疗方法是化疗，常用的化疗药物有顺铂、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱和放线菌素D等。然而化疗药物具有较大的毒副作用且较易产生耐药性，导致化疗的临床疗效并不是很理想。因此，寻找新的能够杀伤卵巢癌细胞的化合物和天然产物具有十分重要的意义。药用植物用来治疗肿瘤已有几千年的历史，据统计世界上已有3 000多种植物用于肿瘤的治疗[2]。木香烃内酯是一类来源于多种草药的倍半萜内酯类化合物，其具有消炎、抗氧化、抗血管新生以及抗肿瘤等特性，但对卵巢癌细胞系的作用及对卵巢癌中NF-κB信号通路的影响并不清楚。本研究以卵巢癌细胞系Skov3为研究对象，观察了木香烃内酯对Skov3细胞增殖、凋亡及NF-κB信号通路的影响，现将结果报道如下。

1 实验资料

1.1药物、试剂与仪器 木香烃内酯由南开大学提供，纯度>98%，用DMSO配制成20 mmol/L储备液，分装保存入-20 ℃备用。RPMI1640培养基、胰酶和胎牛血清购自Gibco公司，MTT和DMSO购自sigma公司。流式细胞仪为美国BD公司，Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒购自BD公司。NF-κB p65、Caspase-3、Caspase-9和β-actin蛋白抗体购自CST公司，化学发光显色试剂购自Thermo公司。

1.2细胞株 人卵巢癌细胞系Skov3由天津医科大学总医院提供。

1.3实验方法

1.3.1木香烃内酯对卵巢癌细胞系Skov3生长影响实验 采用MTT法检测。取对数生长期的Skov3细胞，细胞计数后调整细胞浓度至5×104mL-1，将细胞铺入96孔板中，每孔200 μL，使每孔最终细胞数为1×104/孔。将96孔板放入细胞培养箱中12 h使细胞贴壁。取保存于-20 ℃的木香烃内酯化合物，按照浓度梯度稀释，按照一定的体积加入终浓度为0.25，0.5，1，2.5，5，10, 20 μmol/L的木香烃内酯。木香烃内酯作用72 h后，每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，放入培养箱中孵育4 h。孵育结束后，2 000 r/min离心15 min，弃上清。沉淀用200 μL DMSO重悬，充分溶解后检测OD 570 nm吸光值。

1.3.2木香烃内酯对卵巢癌细胞系Skov3凋亡影响实验 取对数生长期的Skov3细胞，用胰酶消化后进行细胞计数，并调整细胞浓度5×104mL-1，将细胞铺入6孔板中，每孔最终细胞数为5×104，体积为1 mL。将6孔板放入细胞培养箱中孵育12 h使细胞完全贴壁。按照一定体积加入木香烃内酯使总浓度分别为0.5，1，2.5，5 μmol/L。同时设置对照孔，每个浓度设置3个复孔。放入37 ℃细胞培养箱中培养24 h。24 h后，将细胞收集于流式管中，1 200 r/min离心7 min后弃上清。沉淀用100 μL 1×binding buffer重悬，每管分别标记5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室温避光孵育15 min后，每管补加200 μL 1×binding buffer，于1 h内流式检测细胞凋亡率，注意设置单阳管。根据细胞凋亡时细胞所表现出来的特征把细胞分为3类，Annexin V+/PI+为中晚期凋亡细胞，Annexin V+/PI-为早期凋亡细胞，Annexin V-/PI-为活细胞，早期细胞凋亡率和中晚期细胞凋亡率合计为细胞凋亡率。

1.3.3木香烃内酯对卵巢癌细胞系Skov3中NF-κB p65基因表达影响实验 取对数生长期的Skov3细胞，调节细胞浓度为5×104mL-1，按照1 mL/孔接种于6孔板中。37 ℃孵箱中培养12 h使细胞完全贴壁后加入终浓度为1，2.5，5 μmol/L的木香烃内酯处理，24 h后收集细胞。将细胞用Trizol裂解，Trizol法提取细胞内部RNA，采用RT-PCR法检测NF-κB p65基因表达情况。以GAPDH为内参照，以DMSO为对照，计算ΔΔCt值。

1.3.4木香烃内酯对卵巢癌细胞系Skov3中NF-κB及凋亡相关蛋白表达影响实验 采用Western Blot法检测。取对数生长期的Skov3细胞，调节细胞浓度为5×104mL-1，按照1 mL/孔接种于6孔板中。37 ℃孵箱中培养12 h使细胞完全贴壁后加入终浓度为1，2.5，5 μmol/L的木香烃内酯处理，24 h后收集细胞。将细胞用200 μL RIPA重悬，冰上裂解30 min(每10 min震荡混匀1次)，然后12 000 r/min 4 ℃离心15 min，吸取蛋白上清。在蛋白上清中加入5×载样缓冲液，100 ℃煮样5 min使蛋白充分变性。配制12%的蛋白胶进行SDS-PAGE电泳，上层浓缩胶电压为60 V，下层分离胶为110 V。电泳完成后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶室温封闭1 h后，孵育NF-κB p65、Caspase-3和Caspase-9一抗过夜，洗去未结合的一抗后孵育一定比例稀释的二抗，然后进行化学发光显色。

1.4统计学方法 数据采用GraphPad Prism 5软件进行处理分析，组间比较采用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1木香烃内酯对卵巢癌细胞系Skov3生长影响0 μmol/L木香烃内酯对细胞生长抑制率为(0.30±1.60)%，0.25 μmol/L为(2.28±1.13)%，0.5 μmol/L为(10.37±1.48)%，1 μmol/L为(30.04±1.40)%，2.5 μmol/L为(35.04±2.37)%，5 μmol/L为(46.34±3.06)%，10 μmol/L为(67.03±2.42)%,20 μmol/L为(73.25±4.26)%，50 μmol/L为(84.47±2.54)%。在0～50 μmol/L浓度范围内木香烃内酯对Skov3细胞的生长抑制作用具有明显的浓度依赖性，木香烃内酯对Skov3细胞的IC50为5.11 μmol/L。

2.2木香烃内酯对卵巢癌细胞系Skov3凋亡影响经过不同浓度木香烃内酯处理Skov3细胞24 h后，细胞开始出现明显凋亡。随着木香烃内酯浓度的增加，凋亡细胞的比例明显增加，其中木香烃内酯0 μmol/L时细胞凋亡率为(7.40±2.90)%，2.5 μmol/L时为(11.84±0.95)%，5 μmol/L时为(21.89±1.93)%，10 μmol/L时为(57.6±3.39)%，20 μmol/L时为(84.1±0.78)%，各浓度间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图1及表1。

2.3木香烃内酯对人卵巢癌细胞系Skov3中NF-κB基因表达影响 不同浓度木香烃内酯处理24 h后，NF-κB基因表达量浓度依赖性的下调，各浓度间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图2。

图1 不同浓度木香烃内酯诱导卵巢癌细胞系Skov3凋亡代表性散点图

表1 不同浓度木香烃内酯诱导人卵巢癌细胞系Skov3凋亡情况

图2 不同浓度木香烃内酯组NF-κB p65基因表达情况

2.4木香烃内酯对卵巢癌细胞系Skov3中NF-κB蛋白以及凋亡相关蛋白影响 不同浓度木香烃内酯处理24 h后，5 μmol/L和10 μmol/L木香烃内酯组细胞内NF-κB p65和Caspase-3蛋白浓度均明显低于2.5μmol/L木香烃内酯组(P均<0.05)，5μmol/L和10 μmol/L 木香烃内酯组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；10 μmol/L木香烃内酯组Caspase-9蛋白浓度明显低于2.5 μmol/L和5 μmol/L木香烃内酯组(P均<0.05)，2.5 μmol/L和5 μmol/L木香烃内酯组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3及表2。

3 讨 论

图3 不同浓度木香烃内酯组卵巢癌细胞系Skov3中NF-κB蛋白及凋亡相关蛋白表达情况

表2 不同浓度木香烃内酯组卵巢癌细胞系Skov3中NF-κB蛋白及凋亡相关蛋白水平比较

注：①与2.5 μmol/L木香烃内酯组比较，P<0.05。

木香烃内酯主要来源于风毛菊属和月桂属植物的根部，对白血病、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌以及膀胱癌等多种类型的肿瘤细胞具有明显的杀伤作用[3]，其在抗肿瘤中的主要作用有诱导细胞周期阻滞、细胞凋亡、抑制Wnt/β-Catenin信号通路、端粒酶活性抑制、抑制肿瘤侵袭和迁移等[4-7]。本研究结果显示，木香烃内酯对人卵巢癌细胞系生长有明显抑制作用，且随着木香烃内酯浓度的提高，细胞凋亡率明显升高，说明木香烃内酯主要是通过诱导细胞凋亡来实现其抗肿瘤作用的。而诱导细胞凋亡的机制有很多，Yang等[8]发现木香烃内酯能够通过诱导细胞内部ROS的积累从而诱导细胞凋亡。Butturini等[9]在急性髓系白血病中的研究发现木香烃内酯能够抑制STAT3的磷酸化以及其与DNA的结合。

NF-κB是细胞核内重要的转录因子，参与多种基因的表达和调控。NF-κB蛋白家族包括p50/p105、p52/p100、RelA/p65和C-Rel，其中RelA/p65 是NF-κB家族常见的重要转录因子，在肿瘤发生、发展以及恶化过程中起重要作用，且参与多种肿瘤相关基因的转录调控，因此NF-κB可以作为肿瘤治疗的重要靶点[10]。目前报道的靶向NF-κB从而发挥抗肿瘤作用的化合物主要包括小白菊内酯、含笑内酯以及Da0324等[11-13]。Lin等[14]研究表明抑制NF-κB能够激活Caspase家族蛋白从而诱导细胞凋亡。本研究结果显示，木香烃内酯能够抑制卵巢癌细胞中的NF-κB基因和蛋白的表达并呈明显的浓度依赖性，促进Caspase-3和Caspase-9的剪切，从而诱导卵巢癌细胞凋亡。

综上所述，木香烃内酯可通过抑制NF-κB基因及蛋白表达，激活Caspase-3和Caspase-9而诱导卵巢癌细胞的凋亡，为卵巢癌的治疗提供了新的选择和思路。

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