长链非编码RNA SPRY4-IT1对宫颈癌细胞的生物学行为影响

宋 燕，吴琼蔚

(上海市长宁区妇幼保健院，上海 200051)

全世界范围内，宫颈癌已成为女性发病率仅次于乳腺癌的第二大常见恶性肿瘤和女性癌症死亡的第三大原因[1-3]。人乳头状瘤病毒(HPV)的预防性疫苗对宫颈癌的预防有重要意义，但晚期复发的子宫颈癌治疗效果差，病死率高，且宫颈癌的发病机制目前仍不清楚。 因此，研究宫颈癌细胞侵袭、转移的分子机制，寻找有效的诊断和鉴定的分子治疗靶点，可能有助于子宫颈癌患者的治疗。长非编码RNAs(long noncoding RNA，lncRNAs，大于200个核苷酸的长度)主要通过表观遗传学、转录及转录后水平调控基因的表达，从而参与机体的生物学功能，是具有蛋白编码能力的lncRNA家族的新成员[4-6]。新的证据表明，lncRNAs具有重要的生物学功能，与人类癌症密切相关[7-8]。SPRY4内含子转录本1(SPRY4 intronic transcript 1，SPRY4-IT1)属于lncRNA的一种，来自SPRY4基因内含子的一个过程，其在多种肿瘤中表达上调，可促进肿瘤细胞的增殖分化侵袭，同时抑制细胞凋亡[9-10]。在宫颈癌的致病基因中已经发现多种与其密切相关的lncRNAs，如HOTAIR、H19、GAS5、MEG3等[11-14]，为目前宫颈癌发病机制的研究以及早期诊断和治疗提供了重要的分子靶点和理论依据。新近研究发现，lncRNA SPRY4-IT1在骨肉瘤、胃肠道等多种肿瘤中表达异常，SPRY4-IT1是骨肉瘤的致病基因之一[7]。但lncRNA SPRY4-IT1在宫颈癌中的表达及作用报道较少，因此，本研究着重探讨了lncRNA SPRY4-IT1在宫颈癌细胞中的表达及其对细胞生物学行为的影响。

1 实验资料

1.1细胞株及培养 人宫颈癌细胞株HeLa 和正常人宫颈永生化上皮细胞系H8(NC细胞)购自中国科学院中国细胞库(上海)。所有的细胞用10%热灭活胎牛血清、100 IU/mL链霉素和100 μg/mL青霉素DMEM培养液，放置在37 ℃含5% CO2的潮湿空气中培养。

1.2RNA提取和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)按Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNAs，按照说明书用引物和上标Ⅱ寡聚脱氧胸腺嘧啶逆转录酶逆转录为cDNA(Invitrogen)。在20 μL含有SYBR Green反应混合物作用下反应组合共扩增出3个复制的样本(Qiagen公司，德国)和0.5 mm的引物，并用罗氏(Roche) LightCycle分析(巴塞尔，瑞士)。引物的序列：SPRY4-IT1上游为5’- AGCCACATAAATTCAGCAGA-3’，下游为5’-CGATGTAGTAGGATTCCTTTCA-3’;GAPDH上游为5’-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3’，下游为5’-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3’。用ABI7500进行所有qRT-PCR数据的收集。

1.3siRNA和质粒DNA转染 HeLa细胞及NC细胞分别接种于6孔板, 用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、50 mL/L CO2细胞培养箱中培养。适量细胞接种在25 mm2培养皿中，至80%融合后,按照Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA)及®FuGENE HD转染试剂(罗氏，德国)说明书操作，孵育48 h后获得转染细胞，通过qRT-PCR检测其表达和清除效率。两种si-SPRY4-IT1目标序列(Invitrogen公司建造提供)包括si-SPRY4-IT1-1(CCCAGAATGTTGACAGCTGCCTCTT)和si-SPRY4-IT1-2(GCTTTCTGATTCCAAGGCCTATTAA)，后者具有最高的抑制功效。为了实现SPRY4-IT1异位表达，合成SPRY4-IT1序列(708 bp)亚克隆到pEGFP-N1质粒载体。在SPRY4-IT1序列插入载体中后，进行测序分析以确保这个载体可以特异表达SPRY4-IT1。收集处于对数生长期的HeLa细胞及NC细胞，提取细胞总RNA，采用qRT-PCR法检测SPRY4-IT1表达情况。si-SPRY4-IT1转染HeLa细胞48 h后，抽提细胞总RNA，并进行反转录，qRT-PCR法检测SPRY4-IT1 mRNA表达情况。

1.4细胞增殖检测 MTT法测定细胞增殖情况。将浓度为1×104L-1细胞液接种孵育于96孔培养板上。根据制造商的指导用脂质体2000将si-SPRY4-IT1和si-NC转染成细胞，然后孵育在37 ℃，加入质量分数为5 mg/mL的MTT(20 μL/孔)培养基中，培养4 h后取出，弃上清，加入DMSO(Sigma Aldrich)150 μL/孔，震荡10 min，使MTT还原产物完全溶解。分别于溶解后的24 h、48 h、72 h在570 nm处测定各孔吸光度OD值。所有的实验都进行3次。克隆形成试验：收集转染细胞接种于密度为1 000个细胞/孔的六孔培养板中，在37 ℃和5% CO2条件的孵化器内培养2周。然后用10%甲醛固定30 min后，用1%结晶紫对菌落进行染色，每次5 min，用光学显微镜计数和计算各组的菌落数。结果取平均值。

1.5细胞凋亡及凋亡周期的检测 转染的细胞用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤并用胰酶消化细胞制成悬液，固定在冰冷的乙醇中。加入浓度为2 mg/mL牛胰RNase(Sigma Aldrich)在37 ℃下培养30 min后，细胞再用20 mg/mL碘化丙啶染色(PI，Sigma Aldrich)，在室温下培养20 min后检测细胞凋亡情况。根据细胞凋亡检测试剂盒标记的Annexin vfitc(Invitrogen)进行操作，用流式细胞仪(BD Biosciences,Mansfield,MA,USA)定量分析细胞周期分布和细胞凋亡率。

1.6细胞体外迁移和侵袭实验 细胞转染成功后，应用Transwell侵袭实验试剂盒检测其侵袭力变化(8ìm pore;BD Biosciences,San Jose,CA USA)。入侵检测：用100 μL无血清培养基重悬细胞加入Matrigel上室，将500 μL 10% FBS培养基加入下室，培养24 h后，未侵入细胞表面用棉签擦拭除去，侵入到下室的细胞甲醇固定，0.1%结晶紫染色，干燥，并拍照。迁移实验：将预先准备的100 μL无血清培养的细胞置于无基底膜顶部室，将500 μL 10% FBS培养基加入下室，培养16 h后，表面细胞和骨细胞迁移到下室并固定，如上面所描述的染色。选取5个有代表性的领域，在显微镜下计数入侵或迁移的细胞数量，计算平均值。

2 结 果

2.1SPRY4-IT1在宫颈癌HeLa细胞和NC细胞中表达情况 SPRY4-IT1在HeLa细胞中表达量为3.08±0.12，在NC细胞中表达量为1.08±0.09，二者表达量比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2si-SPRY4-IT1组和si-NC组SPRY4-IT1 mRNA表达情况 si-SPRY4-IT1-1组的SPRY4-IT1 mRNA表达量为0.35±0.04,si-SPRY4-IT1-2组的SPRY4-IT1 mRNA表达量为0.19±0.03，si-NC组的SPRY4-IT1 mRNA表达量为0.98±0.03，si-SPRY4-IT1-1组和si-SPRY4-IT1-2组SPRY4-IT1 mRNA表达量均明显低于NC组(P均<0.05) 。

2.3SPRY4-IT1组和NC组细胞增殖情况 在24 h、48 h、72 h 3个时间点，SPRY4-IT1-1组和SPRY4-IT1-2组与NC组相比，细胞出现明显增殖效应。见图1。

图1 SPRY4-IT1组和NC组细胞增殖情况

2.4si-SPRY4-IT1组和si-NC组细胞增殖情况在24 h、48 h、72 h 3个时间点，si-SPRY4-IT1-1组和si-SPRY4-IT1-2组与si-NC组相比,细胞的增殖力明显下降。见图2。

图2 si-SPRY4-IT1 转染HeLa细胞凋亡情况

2.5si-SPRY4-IT1组和si-NC组细胞周期及凋亡率比较 si-SPRY4-IT1-1组和si-SPRY4-IT1-2组G0/G1期细胞所占比例明显高于si-NC组(P均<0．05)，S期和G2/M期细胞所占比例明显低于si-NC组(P均<0．05)，见表1及图3。si-NC组细胞凋亡率为(4.98±1.27)%，si-SPRY4-IT1-1组为(13.37±2.54)%，si-SPRY4-IT1-2组为(15.21±3.14)%，si-SPRY4-IT1-1组和si-SPRY4-IT1-2组细胞凋亡率明显高于si-NC组(P均<0.05)。见图4。

表1 si-SPRY4-IT1组和si-NC组细胞周期比较%)

图3 si-SPRY4-IT1组和si-NC组细胞周期分布情况

图4 si-SPRY4-IT1组和si-NC组细胞凋亡情况

2.6si-SPRY4-IT1组和si-NC组细胞迁移和侵袭情况 si-SPRY4-IT1-1组和si-SPRY4-IT1-2组细胞迁移和侵袭数量均明显少于si-NC组(P均<0．05)。见表2。

表2 si-SPRY4-IT1组和si-NC组细胞迁移和侵袭情况个)

注：①与si-NC组比较，P<0.05。

3 讨 论

宫颈癌是女性最常见的一种恶性肿瘤,多发生于中老年女性。该病的发病机制不明，现有的治疗方法效果差。宫颈癌细胞的侵袭、转移是宫颈肿瘤患者的主要死亡原因。因此，研究肿瘤细胞的侵袭、转移机制，寻求新的治疗靶点及策略，可为降低宫颈肿瘤患者病死率提供新的思路。

近年研究发现，lncRNAs与人类肿瘤的发生发展密切相关，特定的lncRNAs已被证明是肿瘤发展转移及预后的重要因素[15]。众多的研究团队筛选并发现了可以用于宫颈癌早期临床诊断的microRNA 分子，但是lncRNAs 在宫颈癌发生发展中的作用研究还是比较少见的，许多基因问题还有待于进一步解决。

lncRNA SPRY4-IT1是微小lncRNA,首先报道其与分子病因学有关的是人类黑色素瘤[16]，近年研究发现其参与各种类型肿瘤的发生发展[17-18]。本研究证实SPRY4-IT1可促进HeLa细胞的异常增殖。Peng等[19]研究报道,抑制SPRY4-IT1可以明显降低食管鳞状细胞体外增殖和体内的致瘤性。本研究结果表明,si-SPRY4-IT1 可以抑制SPRY4-IT1表达,显著抑制HeLa细胞增殖, 并且可以明显抑制HeLa细胞的迁移及侵袭能力，表明通过抑制SPRY4-IT1可以抑制宫颈癌细胞增殖促进其凋亡。

综上所述,SPRY4-IT1是宫颈癌的重要致癌基因之一，其表达水平与宫颈癌发病密切相关。SPRY4-IT1是宫颈癌一个潜在的治疗目标和预后的生物标志物，且可能应用于宫颈肿瘤的发病监测，为今后研究宫颈癌侵袭及进展提供了新的分子靶点。

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