PI3K/AKT信号通路与EGFR-TKIs治疗NSCLC耐药的相关性研究进展

李 静 综述，朱 冰 审校

(重庆医科大学附属第二医院胸心外科 400010)

肺癌的发病率和死亡率在全球范围内整体呈上升趋势，其中NSCLC的发病率约占肺癌发病率的85%[1-2]，包括鳞癌、腺癌、大细胞性肺癌等[3]。多于一半的NSCLC患者被发现时已属晚期，因此系统治疗对于NSCLC患者来说尤其重要。近年来，以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)为靶点的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)对于EGFR具有TKI敏感突变(19外显子缺失突变及21外显子L858R点突变)的NSCLC患者的客观缓解率达70%以上，明显高于传统化疗。然而，临床数据反馈经TKIs治疗后，几乎所有患者不可避免地会产生耐药[4]。其主要机制包括EGFR二次突变、c-Met扩增[5]、PTEN表达降低[6]、胰岛素生长因子受体结合蛋白缺失[7]等。然而仍有部分患者的获得性耐药的原因仍未可知。最近研究发现PI3K/Akt信号通路在EGFR-TKIs产生耐药性中也发挥重要作用。

PI3K/Akt信号通路对细胞的增殖和生存起重要作用，该通路某些成分的突变导致的功能的获得或缺失会引起细胞转化。研究表明，PI3K/Akt 这条信号通路贯穿于NSCLC的发生发展过程，活化的PI3K/Akt通路通过激活下游多种信号转导而促进肿瘤进展。近期研究发现，肿瘤细胞对EGFR-TKIs产生的多种耐药性都与PI3K/Akt信号通路的激活紧密相关，因此研究 PI3K/Akt 信号通路在NSCLC对EGFR-TKIs 产生耐药的过程中如何发挥作用或能为解决耐药性问题提供新思路[8]。本文就对PI3K/Akt 信号通路在EGFR-TKIs 耐药性的研究作一综述。

1 膜蛋白与EGFR-TKIs的耐药

1.1腺苷酸转移酶(Adenine nucleotide translocase，ANT) ANT属于真核细胞线粒体内膜上转运蛋白家族的成员，其作为代谢物载体参与线粒体的各种代谢活动。ANT 在线粒体内膜上分布最丰富，约为细胞线粒体总蛋白的1%～10%，其功能主要是催化细胞质中 ADP 和线粒体内 ATP 进行跨膜交换[9]。

ANT也与BCL2家族蛋白相互作用，调节线粒体膜渗透性及由线粒体介导的细胞凋亡。人类细胞中发现有4种ANT异构体，分别编号为ANT1、ANT2、ANT3、ANT4。ANT的表达与细胞、组织及细胞、组织的分化发育状态有关。具体来说，ANT3几乎低表达于所有细胞且与氧化磷酸化有关。ANT1大量表达于分化末期细胞。相反地，ANT2高表达于生长增殖能力很强的未分化细胞，如淋巴细胞、肝肾细胞等。并且ANT2在几种特殊人类肿瘤中高表达于ANT1。应当注意的是ANT1和ANT3扮演前凋亡信号角色，而ANT2通过抑制线粒体膜通透性途径扮演抗凋亡信号角色。更近一步说，ANT2无论在有氧还是厌氧情况下都能促进肿瘤细胞进行糖酵解。这些观察结果表明ANT2是一种致癌分子。持续沉默ANT2会导致线粒体膜电位增加及肿瘤细胞的化疗增敏。之前研究结果表明，在肝癌和乳癌细胞中，经由短发卡RNA敲除ANT2后具有抗肿瘤效应。

JANG等[10]发现在NSCLC细胞系中，ANT2低表达于EGFR-TKIs敏感细胞中，而高表达于对EGFR-TKIs耐药的H1975和HCC827/GR细胞中。进一步研究发现利用ANT2短发夹RNA敲除ANT2基因后可以下调miR-221和miR-222，恢复PTEN表达，下调PI3K/AKT途径，抑制热休克蛋白90(HSP90)的表达，增加肿瘤细胞对EGFR-TKIs的敏感性。临床试验中，利用HSP90抑制剂使EGFR-TKIs对NSCLC致敏也表现出了令人满意的效果。

1.2整合素(integrin) 整合素是细胞黏附分子中一类重要的细胞表面受体家族，由α和β两个亚基组成的跨膜异二聚体，α和β亚基均由长的胞外区、跨膜区和短的胞内区组成，主要介导信息从细胞外基质向细胞内传递，调控细胞与细胞外基质的黏附和细胞间的黏附，并参与调控细胞的增殖、分化、伸展与迁移等。因此整合素的信息传递在促进肿瘤细胞失控制性生长、肿瘤细胞的去分化与远处转移中发挥重要作用。整合素是最重要的黏附分子之一，已有数据表明它参与肿瘤细胞耐药[11]。

DENG等[12-13]发现整合蛋白β1能够抑制吉非替尼诱导的PC9/G细胞凋亡。并且整合蛋白在PC9/G细胞内大量表达，而将整合蛋白敲除后，会恢复PC9/G细胞对吉非替尼的敏感性。这些结果表明整合蛋白能够促进EGFR靶向药物耐药的发展。并且，由整合素基质锚定介导的最重要的下游信号通路是PI3K/AKT途径和丝裂原活化蛋白激酶途径。它们在肿瘤的发生和化疗药物耐受性的产生具有重要作用。这些结果表明以整合蛋白β1为研究目标或许可以找到克服NSCLC对EGFR-TKIs耐药的方法，但这仍需更多的实验及临床数据的支持。

2 激酶类

2.1Anexelekto(AXL) AXL激酶是酪氨酸激酶受体家族成员的一份子，并与EGFR共享下游信号通路，如PI3K/AKT 途径和MAPK/ERK途径。AXL激酶能介导许多肿瘤耐药的产生，例如，HER2阳性的乳腺癌细胞对拉帕替尼的耐药，头颈癌细胞对埃罗替尼的耐药，慢性粒细胞性白血病细胞对尼罗替尼的耐药等。研究显示，对EGFR-TKI初始反应良好的患者，约有19%的患者AKL激酶表达水平会升高，并最终会产生耐药。TIAN等[14]发现AXL激酶在对吉非替尼耐药的PC9GR细胞中的表达水平比对照组的PC9细胞的表达水平要高。并且通过AXL抑制剂或其他特殊方法抑制AXL激酶的表达后，其下游信号通路AKT和ERK的磷酸化水平会相应升高。分析表明AXL激酶介导的NSCLC对EGFR-TKI的耐药是通过PI3K/ AKT和MAPK/ERK1/2的途径激活来实现的。这与给NSCLC使用AUY92能有效克服AXL介导的EGFR-TKI耐药的结果一致。当然这还需要更多的临床研究来探究AXL在NSCLC对EGFR-TKI耐药中的作用。

2.2PAKs(p-21活化激酶) PAKs相对分子质量为21×103是Rho家族的小GTP 酶； 哺乳动物中 PAK有6 种，可分成第 1 组 PAKs( 包括PAK1 ～ 3) 和第2组PAKs(包括PAK 4～6) 。第1个被鉴定并且被研究最多的 PAK 家族成员为PAK1(p-21活化激酶1)，PAK的效应蛋白是Rac和Cdc42，与细胞形成、运动、生存和增殖紧密相关；并且，PKA1在肿瘤的发生发展过程中，也发挥着重要的作用[15]。髓样细胞白血病-1(myeoid cell leukemin-1,Mcl-1)基因在细胞的生存中起着重要的作用，其他抗凋亡分子在Mcl-1缺失的情况下会失去作用。WU等[16]发现由PI3K/AKT/C/EBP-b/miR-145级联反应产生的PAK1能够持续激活PI3K/AKT信号通路，进而增加Mcl-1的表达，从而导致吉非替尼耐药的发生。当吉非替尼联用PI3K抑制剂LY294002或联用AKT抑制剂哌立福辛时，能够克服PC9GR细胞或PAK1高表达的PC9细胞的耐药。并且在裸鼠PC9GR细胞系移植瘤或PAK1高表达的PC9细胞系移植瘤模型中，使用吉非替尼连用AKT抑制剂或PAK1抑制剂时，上述两种细胞的生长被完全抑制。

3 核苷酸

3.1长链非编码RNA(lncRNAs) lncRNAs通常是指一组长度超过200个核苷酸而不编码蛋白质的核苷酸，它们的作用是调节分子基因和细胞进程，如细胞凋亡，肿瘤的侵入、迁移、远处转移及耐药的产生等。各种研究表明lncRNAs包括UCA1、HOTAIR、H19、CUDR、AK126698 和MALAT1，与化疗和EGFR-TKIs耐药相关。PAN等[17]发现在NSCLC细胞系中，BC087858在TKIs获得性耐药的细胞(H1975,PC9/R and PC9/G2)的表达水平比原发性耐药的(H23和H460)要高。并且BC087858 mRNA水平在已经形成EGFR-TKIs耐药的患者体内比还没接受TKIs治疗的患者体内明显要高。当统计无进展生存期(PFS)的时候，BC087858高表达的人群的预后明显比低表达的人群要差。进一步研究发现，BC087858通过上调Snail 和 ZEB1来激活PI3K/AKT、MEK/ERK及EMT通路。并且下调BC087858表达会部分减少PC9/R和PC9/G2细胞对吉非替尼的耐药。同时在离体实验中，敲除BC087858后，也会部分恢复PC9/R和PC9/G2对吉非替尼的敏感性。

3.2小分子核糖核酸(miRNAs)-21 miRNAs是一类长度约 19～22个核苷酸的单链非编码 RNA，它能够与靶基因mRNA3′UTR区同源结合，抑制mRNA翻译或使mRNA降解。miRNAs参与调节多种重要的细胞功能，如细胞分化、增殖、凋亡及肿瘤发生等。miR-21 是一种原癌 miRNAs，在大多数肿瘤中都有表达。miR-21 可通过抑制多种靶基因，来调控细胞增殖、转移、侵袭、凋亡及耐药性的产生。LI等[18]发现，相较于对EGFR-TKIs敏感的PC9细胞系，miR-21在对EGFR-TKIs耐药的PC9′R细胞系中呈现过表达状态。PTEN和PDCD4在PC9′R表达减少，且PI3K/Akt信号通路激活。而miR-21抑制剂能够抑制PC9′R细胞系的增殖，并同时诱导其凋亡。同时miR-21抑制剂能够上调PTEN和PDCD4的表达及抑制PI3K/Akt信号通路的活化。并且这些结果在PC9′R移植瘤治疗的过程中得到了再一次证实。上述结果说明miR-21与NCCLC对EGFR-TKIs产生耐药密切相关。

3.3miR-223 胰岛素样生长因子1(IGF1R)是miR-223的靶向受体，上调miR-223的表达会导致IGF1R的表达受抑制。在NSCLC中，IGF1R是酪氨酸激酶的重要受体，并且IGF1R也是Akt的上游调节受体。HAN等[19]通过实验发现,相比于PC9细胞，miR-223在PC9/ER细胞中的表达水平下降88%。而在HCC827/ER中，miR-223的表达水平则是HCC827细胞中的1.5倍。并且IGF1R mRNA在PC9/ER细胞中的表达水平也是大量增加。在PC9/ER细胞中，通过病毒载体转导的miR-223过表达会抑制IGF1R/PI3K/Akt信号通路，并会部分逆转PC9/ER细胞对埃罗替尼的耐受性。此外，miR-223介导的IGF1R或Akt的磷酸化能够被IGF1R激动剂消除，这也表明了miR-223介导的IGF1R mRNA及蛋白质表达水平的下调会导致IGF1R/PI3K/Akt/mTOR信号通路的抑制。这些结果证明miR-223表达水平的下调会激活PC9/ER细胞中的IGF1R/PI3K/Akt信号通路，进而导致PC9/ER细胞对埃罗替尼耐药性的产生。在裸鼠移植实验中，经慢病毒转导的过表达miR-223同样会抑制IGF1R/PI3K/Akt信号通路并部分逆反PC9/ER细胞对埃罗替尼的耐药性。

4 胞吐调节蛋白SCRN1

SCRN1是分泌素家族中的一员，其相对分子质量约50×103，是存在于多种正常组织器官中的溶质蛋白，其功能是参与胞吐的调节。这种蛋白在各种恶性肿瘤如胃癌、前列腺癌、结直肠癌等中的表达都有上调[20]。KIM等[21]观察到SCRN1在NSCLC的PC9、NCI-1975、NCI-H1650细胞系接受EGFR-TKIs治疗耐药后的表达在呈现上调状态，并且在抑制SCRN1的表达后，这些耐药细胞株对FGFR-TKIs的敏感性得到恢复。这种结果在裸鼠移植瘤实验中同样得到了证实。

5 中医药

中医药治疗肿瘤历史悠久，其具有毒性小、安全有效、多靶点等优点，伴随着EGFR-TKIs在NSCLC治疗中越来越多的应用，寻找EGFR-TKIs药物获得性耐药的制剂正受到越来越多的关注[22]。

5.1蟾毒灵 蟾毒灵是中药蟾皮的主要活性成分之一，具有较好的抗肿瘤活性。研究结果显示，蟾毒灵可以下调EGFR和CMet的磷酸化水平，阻断下游的PI3K/AKT信号通路的激活来逆转吉非替尼耐药达到增强吉非替尼的抗癌作用。康小红等[23]发现在外源性和内源性肝细胞生长因子(hepatocyte grouth factor,HGF)存在的情况下，阿法替尼均不能显著抑制H1975肺癌细胞增殖，而阿法替尼加用蟾毒灵后却能显著抑制肿瘤细胞生长，与单用阿法替尼或单用蟾毒灵相比，差异有统计学意义(P<0.05)。Transwell实验结果也显示，阿法替尼与蟾毒灵联合使用后，可明显抑制H1975肺癌细胞的侵袭能力，与单用阿法替尼或蟾毒灵相比，差异有统计学意义(均P<0.05)。蛋白质印迹结果显示，在HGF的刺激下，阿法替尼能够抑制EGFR活化，抑制p-EGFR蛋白的表达，但并不能阻止p-cMet蛋白的表达而阻断EGFR下游PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路的激活；但阿法替尼合用蟾毒灵能显著抑制p-EGFR、p-cMet、p-AKT、p-ERK蛋白的表达。这表明蟾毒灵可能经抑制cMet/PI3K/ AKT和cMe/MAPK/ERK信号通路而逆转HGF诱导的H1975肺癌细胞对阿法替尼的耐药。在临床实验中蟾毒灵是否也有这样的作用，还需进一步探讨[23-24]。

5.2告达庭 告达庭是中药白首乌中的一种C21甾体苷元，研究发现它具备较好的抗肿瘤活性。范方田等[25]发现吉非替尼合用告达庭对外源性 HGF 诱导的 PC-9 获得性耐药有较好的逆转效应，其抑制增殖作用明显强于各单药组。研究发现，告达庭能通过抑制Met/PI3K/Akt 通路从而恢复PC-9细胞对吉非替尼的敏感性。实验结果表明，告达庭对EGFR磷酸化水平无显著影响，但能抑制Met 和 PI3k/Akt 磷酸化水平；吉非替尼合用告达庭能同时显著抑制 EGFR、HGF-Met信号通路，这表明告达庭通过抑制 Met/PI3K/AKT 通路从而发挥逆转肿瘤细胞的耐药效应[25]。但告达庭的这种逆转耐药的效应还需体外实验和大量的临床研究进一步证实。

6 总 结

肺癌作为临床最常见的恶性肿瘤之一，发病率和病死率在全球范围内整体呈上升趋势。以吉非替尼为代表的EGFR-TKIs对EGFR 具有 TKIs敏感突变的NSCLC的客观缓解率明显高于传统化疗。然而近乎所有的患者用药后都会不可避免的产生耐药，而产生耐药的机制至今尚不完全清楚。PI3K/AKT信号通路与肺癌产生耐药的关系密切，阐明PI3K/AKT信号通路与肺癌耐药的关系或为肿瘤耐药的治疗指明新的方向。然而国内外关于PI3K/AKT信号通路与肺癌耐药的研究证据尚不足，仍需临床科研工作者再接再厉。

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