阿法替尼调控Egr-1/TLR4/mTOR信号通路抑制肝癌细胞Hep3B增殖迁移侵袭及促进细胞凋亡的机制

李 晶 赵 静 孟德峰

1.开滦总医院肝胆外科 (河北 唐山， 063000) 2.华北理工大学附属医院

肝癌的主要病因是由乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、酗酒或血色素沉着病等引起的慢性肝脏肿瘤性疾病[1]。现阶段，仅可为大约1/3的肝癌患者提供诸如肝切除术和肝移植之类的治疗程序，并且患者术后复发率高，5年生存率低[2]。因此，阐明肝癌进展的潜在机制，以便开发出可有效对抗肝癌的治疗药物至关重要。阿法替尼是表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，被批准用于一线治疗患有EGFR突变的晚期非小细胞肺癌[3]。研究表明，阿法替尼单用或与Mithramycin A联合使用对肝癌HepG2细胞增殖具有抑制作用，对细胞凋亡具有诱导作用[4]。然而其对肝癌Hep3B细胞增殖、转移和凋亡的影响与机制目前还未有报道。早期生长反应因子1 (Egr1)/Toll样受体4(TLR4)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路参与肿瘤进展，与癌细胞增殖、迁移等生物学过程密切相关[5]。本研究以肝癌Hep3B细胞为对象，研究阿法替尼在细胞增殖、迁移侵袭、凋亡中的功能，并结合Egr-1/TLR4/mTOR信号通路，探索其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 人肝癌细胞系Hep3B购自广州Cellcook Cell Biotechnology，阿法替尼购自美国Selleck，达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM培养基)购自美国HyClone，胎牛血清(FBS)购自美国Gibco，青霉素/链霉素、RIPA缓冲液、增强化学发光检测试剂盒购自上海Beyotime生物技术研究所，Egr-1过表达载体pcDNA-Egr-1、空载对照pcDNA-con购自上海吉玛，RIPA缓冲液购自美国Sigma-Aldrich，细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、活化的(Cleaved)-天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、Egr-1、TLR4、mTOR抗体购自英国Abcam，基质胶购自美国BD Biosciences。

1.2 细胞培养与分组 肝癌细胞Hep3B在DMEM培养基(包含10% FBS和1%青霉素/链霉素)和37℃，5% CO2环境中培养。将对数生长期的Hep3B细胞分为NC组(未处理)，0.5 μmol/L 阿法替尼组(0.5 μmol/L 阿法替尼处理细胞48 h)，1.0 μmol/L 阿法替尼组(1.0 μmol/L 阿法替尼处理细胞48 h)，2.0 μmol/L 阿法替尼组(2.0 μmol/L 阿法替尼处理细胞48 h)，4.0 μmol/L 阿法替尼组(4.0 μmol/L 阿法替尼处理细胞48 h)，阿法替尼+pcDNA-con组(转染pcDNA-con并用2.0 μmol/L 阿法替尼处理细胞48 h)，阿法替尼+ pcDNA-Egr-1组(转染pcDNA-Egr-1并用2.0 μmol/L 阿法替尼处理细胞48 h)。根据制造商的协议，使用Lipofectamine®2000瞬时转染Hep3B细胞，即将3×105个/孔细胞接种在6孔板上，并用pcDNA-Egr-1或pcDNA-con转染汇合度为70%～80%的Hep3B细胞。转染24 h后， 用2.0 μmol/L 阿法替尼进行处理。

1.3 免疫印迹试验(Western Blot)检测CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP2、MMP9、Egr-1、TLR4、mTOR蛋白的表达 用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解总蛋白。离心(12 000 g，5 min)后，用Bio-Rad蛋白质检测试剂盒检测蛋白质浓度。进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以分离等量的蛋白，将其印迹到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并在4℃与一抗孵育过夜。一抗如下所示：抗CyclinD1(1∶1 000)，抗Cleaved-caspase-3(1∶1 000)，抗MMP2(1∶1 000)，抗MMP9(1∶1 000)，抗Egr-1(1∶1 000)，抗TLR4(1∶1 000)和抗mTOR(1∶1 000)。将PVDF膜与二抗(辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔)孵育2 h。最后，使用增强化学发光检测试剂盒检测印迹。以β肌动蛋白(β-actin)为参照，分析蛋白的表达。

1.4 噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖 Hep3B细胞接种于96孔中，每孔2×104个细胞，48 h后，将MTT(终浓度为5 mg/ml)加入到每个孔中，并在37℃下孵育2 h。将DMEM培养基更换为100 μl二甲基亚砜(DMSO)，在室温下孵育，结晶溶解后在酶标仪490 nm处检测吸光度OD。

1.5 流式细胞仪分析细胞凋亡 为了检测Hep3B细胞凋亡，将5 μl磷脂酰结合蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)和5 μl碘化丙啶添加到细胞中，然后在室温下孵育20 min。用流式细胞仪评估细胞凋亡，并用FlowJo软件分析细胞凋亡率。

1.6 Transwell检测细胞迁移侵袭 Hep3B细胞迁移和侵袭能力通过24孔Transwell小室评估。以1∶10稀释的基质胶包被上腔室用于侵袭分析，未涂覆基质胶用于迁移分析。将3×104个Hep3B细胞重悬于100 μl无血清DMEM中，并接种于上腔室，而底部腔室装有800 μl补充10% FBS的DMEM培养基。24 h后，用棉签擦拭未迁移/未侵袭的细胞，并将迁移/侵袭细胞在室温下用4%聚甲醛固定5 min，并用0.1%结晶紫溶液染色10 min。在光学显微镜下，对随机选择的3个区域细胞进行计数。

2 结果

2.1 不同浓度阿法替尼对Hep3B细胞增殖的影响 结果显示，0.5、1.0、2.0和4.0 μmol/L阿法替尼组Hep3B细胞的增殖活性和CyclinD1蛋白含量均显著低于NC组(P<0.05)。见图1。

与NC组比较，*P<0.05

2.2 阿法替尼对Hep3B细胞凋亡的影响 结果表明，0.5、1.0、2.0和4.0 μmol/L 阿法替尼组Hep3B细胞的凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白含量均显著高于NC组(P<0.05)。结合2.1结果，选择差异最显著的2.0 μmol/L 阿法替尼展开后续研究。见图2。

与NC比较，*P<0.05

2.3 阿法替尼对Hep3B细胞迁移和侵袭的影响 结果表明，与NC组比较，2.0 μmol/L 阿法替尼组显著减少细胞迁移、侵袭数量，并显著降低Hep3B细胞MMP2、MMP9蛋白的表达(P<0.05)。见图3。

注：与NC比较，*P<0.05

2.4 阿法替尼对Egr-1/TLR4/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响 结果显示，与NC组比较，2.0 μmol/L 阿法替尼组显著降低Hep3B细胞中Egr-1、TLR4、mTOR蛋白的含量(P<0.05)。见图4。

注：与NC比较，*P<0.05

2.5 pcDNA-Egr-1可以逆转阿法替尼对Hep3B细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响 结果表明，与阿法替尼+pcDNA-con组比较，阿法替尼+pcDNA-Egr-1组Hep3B细胞的增殖活性提高，凋亡率减少，细胞迁移数量、侵袭数量增加，并且CyclinD1蛋白含量升高，Cleaved-caspase-3含量降低，MMP2、MMP9、Egr-1、TLR4、mTOR蛋白含量升高(P<0.05)。见图5。

注：与阿法替尼+pcDNA-con比较，*P<0.05

3 讨论

肝癌是医学上的最大挑战之一，其特征是癌细胞转移和手术后复发，预后差、存活率低[6]。因此，有必要阐明肝癌转移和进展的分子机制，并确定肝癌的新治疗策略。本研究评价阿法替尼对人肝癌Hep3B细胞生物学行为的影响以及可能的作用机制。结果表明，阿法替尼抑制了肝癌Hep3B细胞的增殖、迁移侵袭，和诱导细胞凋亡。尽管尚不清楚阿法替尼介导的肝癌细胞生长抑制和凋亡促进的详细机制，但从本研究中发现以下机制：阿法替尼抑制Egr-1/TLR4/mTOR信号传导途径，发挥肿瘤抑制功能。

作为第二代EGFR TKI，阿法替尼是一种口服不可逆的ErbB家族阻滞剂，可选择性有效地阻断所有相关ErbB家族受体(ErbB1，ErbB2和ErbB4)的信号传导[7]。除了非小细胞肺癌，阿法替尼逐渐成为多种肿瘤的潜在治疗选择，如卵巢癌[8]、肺鳞状细胞癌[9]、乳腺癌[10]、胃癌[11]等。根据报道，在肝癌HepG2细胞中，阿法替尼可降低CyclinD1和提高caspase-3表达，起着抗增殖和促凋亡的作用[4]。阿法替尼不仅能有效抑制肝癌Huh-7细胞的增殖、迁移和侵袭，而且还能通过抑制表皮生长因子受体来调节上皮间质转化和转移相关基因的表达水平，这种抑制作用与ERK-VEGF/MMP9信号通路有关[12]。骨肉瘤细胞经阿法替尼治疗后，细胞活性受到抑制，以及迁移性和侵袭性降低，机制与降低ErbB信号通路活性有关[13]。在食管鳞状细胞癌中，阿法替尼通过抑制EGFR下游途径发挥其抗肿瘤作用，并在G1诱导细胞周期停滞和细胞凋亡[14]。本研究的MTT、流式细胞仪、Transwell等数据显示，阿法替尼显著降低肝癌Hep3B细胞的增殖活性、细胞迁移及侵袭能力，并显著提高细胞的凋亡率。此外，阿法替尼还可降低增殖相关蛋白CyclinD1、迁移侵袭相关蛋白MMP2、MMP9的表达，而提高凋亡执行凋亡Cleaved-caspase-3的表达，这些发现证明了阿法替尼在治疗肝癌方面的潜力，与既往研究报道一致[4,11]。

在本研究中，阿法替尼显著降低肝癌Hep3B细胞的Egr-1、TLR4、mTOR蛋白含量，提示阿法替尼抗肝癌细胞增殖转移、促凋亡的功能可能与Egr-1/TLR4/mTOR信号通路有关。Egr-1/TLR4/mTOR信号通路此前已被报道与癌症进展有关。抑制Egr1的表达降低了TLR4/mTOR和炎症细胞因子的表达[15]，还可减慢肝癌HepG2和Hep3B细胞增殖[16]。下调肿瘤相关巨噬细胞中的TLR4后，肝癌Hep3B细胞的迁移和侵袭能力减弱[17]。为了进一步探讨阿法替尼抑癌机制，本研究在肝癌细胞中转染Egr-1过表达质粒pcDNA-Egr-1，上调其表达。结果显示，Egr-1过表达逆转了阿法替尼对Hep3B细胞增殖、迁移侵袭、Egr-1/TLR4/mTOR信号通路的抑制作用，和对Hep3B细胞凋亡的促进作用，此外，阿法替尼降低CyclinD1、MMP2、MMP9表达及提高Cleaved-caspase-3表达的作用也被逆转。这些数据表明，Egr-1/TLR4/mTOR信号通路是阿法替尼影响肝癌Hep3B细胞生长和转移的重要途径之一。

本研究结果表明，阿法替尼可能作为一种有效的肝癌治疗剂，通过抑制Egr-1/TLR4/mTOR信号通路活性，抑制肝癌Hep3B细胞增殖、迁移侵袭，诱导细胞凋亡。为肝癌临床实践提供了一个潜在的治疗选择。