抑制KLF8基因对CD133+肝癌干细胞亚群比例、裸鼠体内成瘤和肺转移能力的影响

石军梅，刘英，刘义冰，王晓翔，刘纯一

(河北医科大学第四医院，石家庄 050000)

肝癌是我国发病率排名前五的恶性肿瘤，也是导致患者死亡的主要癌症之一[1]。肝癌发病的危险因素包括乙肝、丙肝、酒精肝、脂肪肝、遗传或基因突变等[2]。虽然肝癌的诊疗技术已取得了巨大的进步，但是因其具有复发、转移率高及易耐药等特点，仍缺乏有效的治疗手段[3]，导致病死率居高不下。恶性肿瘤的发生发展与肿瘤干细胞(CSCs)密切相关，肿瘤的复发、转移及治疗耐药均有CSCs的参与[4]。肝癌干细胞是CSCs的一种，具有自我更新、无限增殖、多向分化能力的细胞，是肿瘤无限生长的主要原因，也是恶性肿瘤发生复发、转移及治疗耐药的根本原因[6,7]。目前，肝癌干细胞分选及鉴别的常用表面分子标志物有跨膜酪氨酸激酶受体蛋白(CD117、CD133、CD90、CD44)和上皮细胞黏附分子等，其中以CD133为分选标记，经流式细胞分选技术可分选出肝癌干细胞，该方法也是常用的肝癌干细胞识别、分选的方法[8,9]。KLF8基因是上皮间质转化过程中的诱导蛋白，其表达与肿瘤的转移和恶性进展密切相关，也可刺激和促进血管内皮生长因子分泌[10,11]。KLF8基因在肝癌组织中高表达，与肝癌的发生和恶性进展呈一定程度的正相关[12]。我们推测，通过慢病毒质粒敲除肝癌干细胞中KLF8基因的表达将可能抑制肝癌的恶性进展，但以往鲜有报道。本研究观察了抑制KLF8基因表达对肝癌干细胞干性表型、体内成瘤及肺转移能力的影响，以期为肝癌患者的复发、转移或治疗耐药提供新的临床治疗思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 FITC标记的CD133抗人抗体及PE标记的对照抗体(BD，USA)，KLF8基因的干扰慢病毒载体质粒sh-KLF8及对照空载体质粒sh-control(GeneCopoeia构建，USA)，兔抗人KLF8抗体(CST，USA)，Lipofectamine 2000转染试剂、TRIzol试剂(Invitrogen，USA)，RNA抽提试剂盒(Applied Biosystems，USA)，TaqMan逆转录试剂盒(Life Technologies，UK)，qSYBR-Green-containing PCR试剂盒(Qiagen，USA)，Dako两步法免疫组化试剂盒(Dako，丹麦)。Multiskan Ascent酶标仪(Thermo，型号413MBY042078)，奥林巴斯倒置显微镜Olympus IX71(Olympus公司，日本，CCD图像传感器，配合Image-Pro Plus7.0成像系统使用)，紫外可见分光光度计(Thermo，Nanodrop 2000，USA)，BD FACSAriaTM流式细胞分选仪(BD，USA)。

1.2 原代肝癌细胞的分离及干细胞球的培养 ①肝癌肺转移样本收集及原代肝癌细胞分离：选取手术切除的肝癌肺转移标本(经病理科确诊)，将组织样本于无菌体条件下迅速置于RNAlater保存液中，并立即保存于-80 ℃以用于后续实验。该实验的所有过程均遵从赫尔辛基宣言标准，该研究方案经我院伦理委员会批准，且在充分告知可能存在的风险后与该患者签署了知情同意书。取人肝癌肺转移标本约2.5 cm3，置于无菌培养皿内，漂洗2次，3 min/次，将组织剪成约1 mm3的小块，加入1%胶原消化液消化0.5 h，将细胞悬液过0.45 μm的细胞筛，室温下1 000 r/min离心5 min，弃上清，共离心2次，上清液的重悬采用DMEM培养基。最后调整单细胞悬液的浓度为106个/mL，取3 mL单细胞悬液接种到25 mL的培养瓶内。每天显微镜下观察干细胞球的形成情况，约2周后开始有细胞球形成，收集流式细胞仪分选出的CD133+表型的LCSCs，无血清悬浮扩大培养。②干细胞球培养：无血清培养基由DMEM-F12(1∶1)500 mL、B27(1∶50)10 mL、表皮生长因子(20 ng/mL)1 mL和碱性成纤维细胞生长因子(20 ng/mL)500 μL组成。经流式分选出的CD133+表型的肝癌干细胞均培养于含无血清培养基的低吸附六孔板中，细胞均置于37 ℃，饱和湿度，含5%CO2的细胞培养箱内孵育，每5 d加1.5 mL的新鲜培养基以补充干细胞生长所需的生长因子和营养，当干细胞球数量达到约200～300个时进行传代。

1.3 KLF8基因RNA干扰重组慢病毒质粒的转染及感染LCSCs KLF8基因RNA干扰重组慢病毒质粒的转染 含KLF8基因干扰的重组慢病毒质粒(sh-KLF8)及其阴性对照慢病毒空载体质粒(sh-control)是由美国的GeneCopoeia公司构建(均带egfp的荧光标签)。将20 μg重组质粒，15 μg pCMV-delta R8，6 μg PLVX-AcGFP稀释至500 μL双蒸水，加入2×HBS 500 μL及50 μL氯化钙，静置0.5 h后滴入293T细胞培养液中，40 h后收集上清液，经离心微孔滤器过滤后分装，病毒液-80 ℃保存。同法获得对照质粒转染后的病毒液。LCSCs感染：将两种病毒液分别以病毒/细胞数量=18∶1的比例感染经流式分选鉴定的LCSCs，感染3 d后观察荧光的表达量，并加入2.0 μg/mL的嘌呤霉素，继续培养，直到所有细胞均可观察到荧光的表达。

1.4 肝癌干细胞CD133+表型细胞亚群比例检测 收集对数生长期的细胞进行细胞计数，将收集的细胞室温下离心，1 000 r/min 离心5 min，弃上清。PBS清洗细胞2次，1 000 r/min离心5 min，使用PBS调整细胞浓度至5×105，将调整浓度后的细胞平均分为两份，分别将其移至流式管中，一份加入CD133-FITC抗体，一份中加入PE标记的对照抗体，各加入10 μL，分别加入阻断剂20 μL，缓冲buffer 80 μL，将上述试剂充分混匀后，4 ℃条件下避光静置15 min，将标记后的细胞离心，以1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS清洗1次，弃上清，上机检测CD133+表型细胞亚群的比例，上机分选出CD133+表型的肝癌干细胞细胞亚群，用于后续实验。

1.5 RNA提取和qRT-PCR检测 细胞经消化，离心，弃上清，收集沉淀。向沉淀中加入1 mL TRIzol，室温孵育15 min，裂解细胞，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清，按每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡15 s，冰上孵育15 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，缓慢取上清，避免吸入中间层的白色物质，上层水相体积约为所用TRIzol试剂的60%，将吸取的上清置于另一干净EP管内，加入等体积的异丙醇沉淀水样中的RNA，颠倒混勻，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，见RNA沉淀附着于EP管，加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，7 500 r/min，4 ℃离心5 min，弃上清，室温干燥，加入30 μL无RNase水溶解，取1 μL测RNA浓度和纯度，剩余RNA立即放入-20 ℃保存备用。以上述提取的细胞总RNA为模板，按逆转录试剂盒说明书进行操作，逆转录生成cDNA，以cDNA为模板，按qSYBR-Green-containing PCR试剂盒的说明书进行操作，在BioRad IQTM5 Multicolor实时荧光定量系统上检测各组的Ct值并记录。KLF8引物由Invitrogen公司合成，GAPDH为内参，KLF8的相对表达量用2-ΔΔCt来表征，ΔΔCt=(CtKLF8-CtGAPDH)target-(CtKLF8-CtGAPDH)control。反应体系为20 μL，每个样设置3个复孔。

1.6 肝癌干细胞裸鼠体内成瘤能力及肺转移能力观察 ①体内成瘤能力：实验用BALB/c免疫缺陷型裸鼠(SPF级)共10只，2～4周龄，雌性，体质量(20.3±2.7)g。饲养在恒温(20～26 ℃)、恒湿(50%～56%)、无特定病原体的空气洁净层流架内，按SPF级动物饲养标准进行喂养。裸鼠分为LCSCssh-LIFR组和LCSCssh-control组，每组各5只，将构建的稳定干扰KLF8及其阴性对照肝癌干细胞株LCSCssh-LIFR和LCSCssh-control分别经皮下注射到裸鼠体内，注射量为每只5×102，共100 μL。4周后处死裸鼠并解剖，取出瘤体，称量瘤体的重量，该实验的所有操作均符合动物伦理学。该实验经我院伦理委员会批准且所有操作均符合动物伦理学。②肺转移能力：实验用BALB/c免疫缺陷型裸鼠(SPF级)共10只，实验分LCSCssh-LIFR和LCSCssh-control两组(每组各5只)，将构建的稳转细胞株LCSCssh-LIFR和LCSCssh-control分别经尾静脉注射到两组裸鼠体内，注射量为每只1×102，共50 μL。4周后处死裸鼠并解剖，取出肺组织，HE染色，镜下统计肺组织中所有转移灶的个数。免疫组化法检测肺转移灶中KLF8蛋白，标本经甲醛固定后常规石蜡切片，经脱蜡及水化后常规免疫组化染色(按照Dako两步法免疫组化试剂盒的说明书进行操作)，中性树胶封片晾干，显微镜下采集200×的图像，KLF8蛋白表达的定性研究采用直接观察是否在细胞内表达(阳性着色为红棕色)。

2 结果

2.1 肝癌干细胞的形态及感染结果 肝癌患者的肺转移灶经体外分离、无血清悬浮培养及CD133+分选得转移性LCSCs，镜下观察无血清悬浮培养下的LCSCs，发现LCSCs肝癌干细胞球圆而亮，生长状态良好。分别稳定感染敲除KLF8基因及其阴性对照慢病毒质粒到LCSCs干细胞中，倒置荧光显微镜下观察到LCSCs干细胞的荧光表达情况，随着感染时间的增加，LCSCs细胞中荧光的表达量不断增加，最终荧光表达率均达90%以上时表明细胞株构建成功。qRT-PCR结果显示，与LCSCssh-control细胞(1.032±0.031)比较，LCSCssh-KLF8干细胞(0.230±0.032)中KLF8 mRNA相对表达水平降低(P<0.05)。该结果进一步表明稳定敲除KLF8的LCSCssh-KLF8及其对照干细胞LCSCssh-control构建成功。

2.2 两组CD133+表型细胞亚群比例比较 LCSCssh-control组和LCSCssh-KLF8组CD133+表型细胞亚群比例分别为54.71%±1.13%、1.03%±0.03%，两组比较，P<0.05。

2.3 两组裸鼠体内成瘤能力比较 LCSCssh-KLF8组和LCSCssh-control组裸鼠成瘤重量分别为(1.60±0.38)、(6.57±0.25)g，两组比较，P<0.05。

2.4 两组裸鼠体内肺转移能力比较 LCSCssh-KLF8组和LCSCssh-KLF8组裸鼠肺转移灶个数分别为(21.00±0.71)、(1.00±0.31)，两组比较，P<0.05。

3 讨论

肝癌是全球病死率排名第三，发病率排名第五的恶性肿瘤[13]。目前，肝癌的一线治疗手段为肝移植或手术切除，但肝癌的易复发和转移的特点使得一线治疗常常对于该类患者并无明显的效果，长期预后也不能令人满意，晚期肝癌患者的二线治疗常采用动脉化疗栓塞或全身化疗途径，但由于肝癌肿瘤细胞易产生化学耐药，且传统化疗药物的毒性，常导致治疗方案的疗效有限及使用受限[14,15]。大量研究[16]显示，肿瘤细胞中存在一小部分可维持肿瘤细胞异常生长的亚群，这群细胞具有无限增殖分裂和多向分化的能力，该类细胞被认为是导致肿瘤复发转移的根本原因，这类细胞即为CSCs。因此，在肝癌复发和转移患者的治疗中，应该将肝癌CSCs作为肿瘤复发转移治疗的重要靶向细胞，寻找靶向CSCs的靶点，并对该靶点进行有效的干预将是治疗肝癌肿瘤复发转移的关键。

CD133蛋白是人类造血干/祖细胞中发现的一种5次跨膜糖蛋白，其表达特点为随着细胞分化而迅速下调，该特点使CD133成为鉴定和分离CSCs的一个特异性分子标志[17]，CD133是肝癌、前列腺和黑素瘤等多种肿瘤的CSCs标志之一[18～20]。本实验中我们通过从转移性肝癌患者的肺转移灶中分离并培养出原代细胞，经无血清悬浮培养形成肝癌转移灶的肿瘤细胞球，以CD133为肝癌干细胞的分选标记，经流式细胞分选技术分选出CD133+表型的转移性肝癌干细胞细胞亚群LCSCs，后经无血清悬浮培养法富集肝癌干细胞，该方法可行性高，富集的肝癌干细胞也较为可靠。

文献[21,22,12]报道，KLF8在多种肿瘤中存在表达失调的现象，如KLF8在卵巢癌、乳腺癌、胶质瘤和肝癌的原发灶或转移灶中均存在过表达的现象。在肝癌中KLF8的过表达与肝癌患者的疾病恶性程度或恶性进展如淋巴结阳性状态、肿瘤分级增加、远处转移风险的增加及总体生存的降低等密切相关[23,24]。为了进一步挖掘KLF8及CSCs在肝癌复发转移及治疗耐药中的作用，探究KLF8对肝癌干细胞干性表型及体内成瘤及肺转移能力的影响，我们决定采用慢病毒质粒敲低肝癌干细胞中KLF8的表达，以观察上述过程中的变化。通过转染慢病毒质粒抑制KLF8的表达，筛选并成功构建了稳定抑制KLF8的稳转甲状腺癌干细胞株LCSCssh-KLF8及其对照干细胞株LCSCssh-control，镜下观察LCSCssh-KLF8和LCSCssh-control中细胞的荧光表达量，qRT-PCR法检测细胞中KLF8 mRNA，我们也进一步验证了该稳转细胞株构建成功。

本研究显示，敲除KLF8的确可以降低LCSCs肝癌干细胞中的CD133+表型细胞亚群的比例，减少裸鼠体内的成瘤重量和肺转移灶的个数。该结果表明在肝癌干细胞中敲除KLF8可以降低代表肝癌干细胞干性表型的CD133，即抑制KLF8使肝癌干细胞的干性表型降低，降低肝癌干细胞的成瘤和肺转移能力。对于敲低KLF8可降低干细胞干性表型、降低体内成瘤和肺转移能力的原因，结合已有研究，由于多种肿瘤在复发及转移的过程中，存在上皮间质转化的现象，即存在上皮细胞向间质细胞转化的过程，上皮间质转化过程可显著降低钙黏蛋白(E-cadherin)介导的细胞间黏附，使细胞的上皮形态丧失，并获得侵袭性更强的成纤维细胞样的间质细胞表型，上皮间质转化过程和E-cadherin的作用密切相关，E-cadherin功能缺失会使肿瘤细胞的侵袭和转移能力增加，该过程使肿瘤细胞拥有干细胞特征、减少细胞的凋亡和衰老，并促进肿瘤细胞的免疫抑制[25,26]。在肿瘤发生的初期阶段，上皮细胞经上皮间质转化过程转变为原位癌，后续肿瘤细胞经上皮间质转化过程向周围组织扩散，并经血管或淋巴管向远处组织发生迁移，最终形成转移灶[27,28]。而我们知道KLF8是上皮间质转化过程中的诱导蛋白，KLF8可显著抑制上皮间质转化过程中的关键蛋白E-cadherin的表达，与E-cadherin蛋白的表达呈负相关，和细胞侵袭能力呈正相关[10,12]，另外KLF8也可显著刺激和促进血管内皮生长因子的分泌，促进微血管的形成[11]。因此，我们推测敲低KLF8可降低干细胞干性表型、降低体内成瘤和肺转移能力的具体原因，可能是因为敲低KLF8导致KLF8介导的上皮间质转化过程和促进肿瘤微血管形成的过程被抑制而引起的。

总之，抑制KLF8可显著抑制肝癌干细胞的干性表型和体内成瘤、肺转移能力，因此研发靶向敲除KLF8的药物将可能为复发转移性肝癌的临床治疗提供新的思路。