lncRNA在类风湿关节炎患者外周血单个核细胞中的异常表达

袁敏，徐黎明，郑娟，刘立宁，孙焕霞，刘一帆，李春先，郭芳惠，石颜军

(聊城市人民医院，山东聊城252000)

类风湿关节炎(RA)是一种以侵犯关节为主的系统性慢性自身免疫性疾病，该病致残率较高，其发病机制目前尚不清楚[1]。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200 bp的非编码RNA，在细胞增殖、分化及组织器官的发育中具有重要作用[2, 3]。研究证实，lncRNA参与了多种疾病的发生发展，并且可以作为疾病早期诊断和预后判断的生物学标志物。最近研究[4，5]提示，lncRNA可以作为靶向治疗的靶点来达到缓解甚至治愈疾病的目的。目前关于lncRNA在RA中的表达情况以及与RA关系的研究较少。本研究筛选并验证了lncRNA在RA外周血单个核细胞(PBMCs)中的异常表达情况，为RA早期诊断、病情评估及发病机制的探索提供一定的思路。

1　资料与方法

1.1　临床资料

选择2016年7～12月在我院就诊的RA患者63例，男16例、女47例，年龄20～62岁，病情活动指标简化疾病活动指数(SDAI)评分5.3～47(23.13±10.97)分。所有RA患者均符合2010年美国风湿病学会/欧洲抗风湿联盟制定的分类标准。来自健康查体中心的健康志愿者51例作为对照，男10例、女41例，年龄24～60岁。两者性别、年龄具有可比性。本研究通过聊城市人民医院伦理委员会批准，并征得研究对象或家属知情同意。

1.2　PBMCs的分选

使用EDTA抗凝管抽取受试者外周血10 mL，利用人全血单个核细胞分离液进行分选，血细胞分析仪进行细胞计数及单个核细胞的纯度检测。

1.3　lncRNA在PBMCs中的异常表达检测

采用高通量基因芯片技术。选取27例女性RA患者(平均年龄49.02岁)和27例女性健康志愿者(平均年龄51.04岁)，分别随机分成3组，将每组的PBMCs等量混匀，用TRIzol进行充分溶解。芯片检测由上海康成生物技术有限公司完成。采用Arraystar公司人类lncRNA芯片V4.0进行基因检测，该芯片能够检测40 173个lncRNA，lncRNA是从权威公共转录组数据库(包括Refseq、UCSC knowngenes、Gencode等)和高影响因子论文中挑选的。操作步骤如下：采用TRIzol试剂盒提取样本RNA，抽提的总RNA通过mRNA-ONLYTM真核 mRNA提取试剂盒移除rRNA后，使用随机引物反转录成荧光标记的cRNA；cRNA经过裂解、稀释等处理后，均匀的标记于lncRNA表达芯片平台进行芯片杂交。完成杂交的芯片用Agilent DNA芯片扫描仪扫描，再通过Agilent提取数据软件(version 11.0.1.1)对杂交图片进行分析并提取数据，最后用GeneSpingGX v12.1软件包对数据进行标准化和分析。根据倍数变化值大于3倍、P<0.05、荧光信号的原始值>200的条件，筛选出异常表达的lncRNA。对异常表达的基因进行聚类分析，其中红色代表高表达，绿色代表低表达。

1.4　PBMCc中异常表达的lncRNA的验证

选取36例RA患者(男16例、女20例，平均年龄50.34岁)和24例健康志愿者(男10例、女14例，平均年龄48.55岁)，两组性别及年龄比较差异均无统计学意义。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)方法，根据lncRNA长度<2 000个碱基对，在数据库中是否有明确序列，邻近基因是否和RA相关以及两组之间差异倍数是否显著的原则，选取4个lncRNA进行验证。提取受试者的PBMCs，用TRIzol试剂盒提取样本RNA，逆转录合成cDNA。以GAPDH作为内参，采用SYBR green相对定量法进行定量检测。转录引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，引物序列如下：NR_002838上游引物序列为：5′-GAGCCGATCTTACAACCTC-3′，下游引物序列为：5′-TGGATCTCTACTAGCCACA-3′；ENST00000438380上游引物序列为：5′-CGAGCACTGATGAAGTCCACCA-3′，下游引物序列为：5′-TGAAGTCAGCCGCGTTCCAG-3′；ENST00000456270上游引物序列为：5′-AGCCAGCATAACAAGAGTTCC-3′，下游引物序列为：5′-ACACGTTCCAGTAGAATGCC-3′；NR_026812上游引物序列为：5′-ATTTATCGAACCTCACGGAGC-3′，下游引物序列为：5′-TCTTTAGCTTCTGTAGTTCGG-3′；ENST00000566394上游引物序列为：5′-CTAGAGTCCATGTTGGCCTT-3′，下游引物序列为：5′-TGCAGGTCTTCTATGACGTT-3′；GAPDH上游引物序列为：5′-TCTGACTTCAACAGCGACACC-3′，下游引物序列为：5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGT-3′。反应条件：预变性95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30～60 s，40个循环；熔解曲线分析为95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min以便检测引物二聚体或非特性扩增。采用ΔΔCT法进行定量分析，计算2-ΔΔCT，即目的基因表达相对于GAPDH表达的倍数。

1.5　统计学方法

应用GraphPad Prism5软件对数据进行统计分析。两组基因表达情况比较采用非参数Mann-Whitney检验，相关性分析采用Spearman等级相关。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　lncRNA及mRNA在RA患者PBMCs的异常表达

共筛选出异常表达的lncRNA 242个，其中114个高表达，128个低表达。对上述异常表达的基因进行聚类分析，结果显示，在荧光信号原始值<200的情况下，异常表达的lncRNA 469个，其中高表达30个、低表达439个。

2.2　异常表达lncRNA的验证结果

与RA相关的4个异常表达的lncRNA为ENST00000438380、NR002838、NR026812、ENST00000566394，其在RA患者PBMCs中的相对表达量分别为2.59±0.82、5.85±1.86、0.84±0.27、1.96±0.47，在健康志愿者PBMCs中的相对表达量分别为1.12±0.64、3.46±1.05、1.76±0.43、2.39±0.64。RA患者ENST00000438380和NR002838表达水平升高，NR026812表达水平降低(P均<0.01)；ENST00000566394表达水平降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。将该结果与高通量基因芯片结果进行比较，显示上述4个lncRNA的变化趋势一致。

2.3　lncRNAs与SDAI的相关性分析

对ENST00000438380、NR002838、NR026812与RA疾病活动度指标SDAI进行相关性分析，结果显示，ENST00000438380与SDAI呈明显正相关(r=0.784，P<0.01)，NR002838和NR026812与SDAI无明显相关性(r=0.321，P=0.068；r=0.048，P=0.780)。

3　讨论

随着高通量基因测序技术的发展，越来越多的lncRNA被发现。虽然lncRNA不具有编码蛋白的功能，但该类分子通过与RNA、DNA或蛋白质相互作用，影响基因表达的每个环节，包括染色体重塑、基因印记、转录及转录后加工过程，增强或抑制编码基因的表达[2，6，7]。免疫细胞活化的过程伴随着一系列基因的动态表达来达到清除病原体、清除衰老死亡的细胞及消灭异常细胞的作用，而lncRNA在调控免疫细胞基因动态表达及免疫细胞的发育分化过程中发挥重要作用。研究认为，lncRNA参与了自身免疫性疾病的发病过程[8～10]。Zhang等[11]观察了RA患者关节滑膜中lncRNA的异常表达情况，发现了135个异常表达lncRNA，其中62个lncRNA升高，73个表达降低。Yang等[12]在RA动物模型中发现，紫草素通过上调lncRNA-NR024118表达来抑制炎症反应。另有研究[13]发现，LOC100506036通过调节一系列基因表达SMPD1和NFAT1参与RA的炎症反应过程。目前关于lncRNA在RA外周血的异常表达的研究较少。本研究通过高通量基因芯片技术筛选了在RA患者PBMCs中的异常表达的lncRNA，并通过real-time PCR方法进行了结果验证。

由于在RA患者中女性所占比例在2/3以上，因此我们选取了27例女性RA患者，随机分成3组，然后将每组的PBMCs等量混合，减少性别因素的干扰，确保芯片结果的准确性。芯片结果显示，异常表达的lncRNA半数以上都是表达下调，提示RA患者中基因表达缺失或表达量不足在发病过程中起一定的作用。通过对荧光信号原始值分析发现，lncRNA的表达量较mRNA相比普遍偏低，原始值小于200的lncRNA在总的异常表达的lncRNA中所占比例高达66%，与文献[14]报道的lncRNA在细胞组织中低表达相吻合。另外，在lncRNA和编码基因位置位置关系的分析中，发现基因间的lncRNA占50%以上，其次是和编码基因内含子区重叠的lncRNA,编码基因外含子区重叠的lncRNA最少。研究发现，lncRNA在基因表达调控中有重要作用，部分lncRNA对邻近的编码基因有增强子的作用[15]，提示在RA中异常表达的lncRNA通过影响邻近编码基因的表达参与疾病的发生发展过程。Zhang等[11]报道，在RA关节滑膜中部分异常表达的lncRNA比如ENST00000438399、uc004afb.1、ENST00000452247等，在本研究中未发现异常表达或无表达，可能与lncRNA的细胞组织特异性有关。

本研究根据基因表达的荧光信号值、lncRNA的长度是否小于2 000个碱基对以及在数据库中是否有明确序列，选取了4个lncRNA进行定量验证，验证结果与芯片结果相符，但表达倍数有一定差异，其原因可能与基因芯片和real-time PCR定量检测的原理不同有关。此外本研究进行定量PCR验证的样本为男女混合人群，其结果与进行芯片分析的女性人群结果一致，进一步提示了该芯片结果的准确性和代表性。对3个具有统计学意义异常表达的lncRNA与RA病情活动指标SDAI进行相关性分析，结果显示ENST00000438380与SDAI呈正相关，提示该lncRNA可以作为疾病活动度的检测指标，有利于指导RA患者治疗方案的调整。

综上所述，本研究采用基因芯片技术筛查了RA患者外周血中异常表达的lncRNA，通过real-time PCR进行结果验证，证实RA患者PBMCs中异常表达的lncRNA包括NR002838、ENST00000438380、NR026812，其中ENST00000438380可作为评价RA疾病活动性的一个潜在生物标志物，为进一步探索RA的生物学标志物以及发病机制提供了重要线索。

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