聚乙烯亚胺对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞TNF-α表达的影响

张敏，魏萌，李懔，李金玉

(南京医科大学附属淮安第一医院，江苏淮安223300)

脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合征，是危重患者的主要致死原因。脓毒症最常见的致病菌为革兰阴性菌，脓毒症患者病理生理学的变化与革兰阴性菌所产生的内毒素所致的感染反应有重要关系。对于脓毒症的治疗，虽然采用抗菌药物及其他强力支持性措施，但由于一般不能有效中和、灭活内毒素毒性或抑制其诱生的多种活性介质，因此难以从根本上解决其防治问题。严重脓毒症患者的病死率达25%～30%，发生脓毒性休克后，患者病死率高达50%～60%[1，2]。研究发现，内毒素是革兰阴性菌细胞壁的最外层结构，其主要化学成分为脂多糖(LPS)。LPS是由类脂、多糖、蛋白质组成的复合物，在脓毒症的病理演变中具有极其重要的作用。LPS因富含磷酸基团及羟基，在溶液中带有负电荷[3～5]。聚乙烯亚胺(PEI)是最早用于基因转染的阳离子聚合物之一，PEI分子内含有许多氨基，在生理pH下会发生质子化，从而带有正电荷，可以通过静电作用与带负电荷的物质结合。已有文献报道，富阳离子的PEI能够与LPS结合，并且能够吸附液体内游离的LPS[6，7]。2015～2016年，我们采用LPS刺激巨噬细胞产生炎症反应，观察PEI对炎症反应的影响。

1　材料与方法

1.1　材料

小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞(Abelson鼠科白血病病毒诱导的白血病小鼠腹水中提取的单核巨噬细胞)购于武汉大学，PEI-B25(美国Sigma公司)；TRIzol(美国Invitrogen公司)；氯仿(国药集团化学试剂有限公司)；异丙醇(国药集团化学试剂有限公司)；LPS(美国Sigma公司)；焦炭酸二乙酯(美国sigma公司)；Alexa-LPS(美国Invitrogen公司)；DMEM高糖(美国Hyclone公司)；胎牛血清(美国Giboco公司)；两步法RT-PCR试剂盒(Takara Biotechnology)；引物(Takara Biotechnology)；TNF-α ELISA检测试剂盒(中国欣博盛公司)。

1.2　细胞培养与干预

将RAW264.7细胞加入含10%胎牛血清的高糖培养基、5% CO2、37 ℃条件下传代培养。取生长状态良好的细胞，接种于6孔板内，每个板内细胞数约3×105/mL，每个孔内含1.5 mL培养基。生长过夜后，将细胞分为空白组、LPS组、LPS+PEI组。空白组用相同体积的培养基孵育细胞；LPS组加入10 ng/mL LPS，LPS+PEI组先加入10 ng/mL LPS，培养10 min后加入1 μg/mL PEI。

1.3　细胞内TNF-αmRNA表达检测

采用real-time PCR法。用TRIzol法提取细胞内总RNA，并检测其纯度和浓度。以总RNA为模板，逆转录合成第一链cDNA，特异性引物分别扩增TNF-α和β-actin。TNF-α引物序列：上游5′-GGTGCCTATGTCTCAGCCTCTT-3′，下游5′-GCTCCTCCACTTGGTGGTTT-3′；β-actin引物序列上游5′-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′，下游5′-AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′。将得到的逆转录反应液加入到real-time PCR反应体系中，配制10×反应体系(即0.2 μL ROX，0.2 μL SYBR，0.2 μL引物前链，0.2 μL引物后链，3.4 μL水和1 μL cDNA)。将配好的反应体系在PCR仪器上进行扩增，反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，共循环40次。熔解曲线：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以β-actin为内参，TNF-α mRNA的相对表达水平由公式2-ΔΔCt进行计算。

1.4　细胞上清液中TNF-α水平检测

采用ELISA法。各组细胞培养4 h后，取上清液，按照ELISA试剂盒的说明，检测各组上清内TNF-α。按照操作说明书配制不同浓度的标准品、生物素化抗体工作液和稀释液、酶结合物工作液和稀释液、PBS洗涤液。分别设空白孔、标准孔、待测样本孔。在空白孔中加样本通用稀释液100 μL，其余相应孔中分别各加入100 μL不同浓度的标准品和所检测的标本。36 ℃孵箱内孵育90 min。PBS液洗板5次后，在空白孔内加生物素化抗体稀释液(100 μL/孔)，其余孔中各加入100 μL生物素化抗体工作液，36 ℃孵箱内孵育60 min。PBS液体洗板5次后，空白孔中加入酶结合物稀释液(100 μL/孔)，其余孔内各加入100 μL酶结合物工作液，用封板胶封住反应孔，孵箱内36 ℃孵育30 min。PBS液体洗板5次后，每孔内加入显色底物(TMB)100 μL，放入36 ℃孵箱内避光孵育15 min。每孔内加入100 μL终止液，混匀后即刻用酶标仪测量OD450值。

1.5　RAW264.7细胞对Alexa-LPS的吸附情况观察

取生长状态良好的RAW264.7细胞，分为Alexa-LPS组和Alexa-LPS+PEI组。Alexa-LPS组加入10 ng/mL Alexa-LPS；Alexa-LPS+PEI组加入10 ng/mL Alexa-LPS培养10 min后，再加入1 μg/mL PEI。孵育30 min后，弃培养基，加入PBS清洗，低温离心5 min；弃上清液，加入200 μL PBS，制成细胞悬液，上流式细胞仪检测两组细胞的平均荧光光度值。

1.6　统计学方法

2　结果

2.1　各组细胞内TNF-α mRNA表达水平比较

空白组、LPS组、LPS+PEI组细胞内TNF-α mRNA表达水平分别为0.99±0.14、50.79±7.44、38.77±5.24。LPS组TNF-α mRNA表达水平较空白组升高(P<0.01)，LPS+PEI组较LPS组降低(P<0.05)。

2.2　各组细胞上清液中TNF-α水平比较

空白组、LPS组、LPS+PEI组细胞上清液中TNF-α水平分别为6.68±2.99、1 085.00±236.20、753.10±61.46。LPS组TNF-α水平较空白组升高(P<0.01)，LPS+PEI组较LPS组降低(P<0.05)。

2.3　LPS组和LPS+PEI组细胞平均荧光光度值比较

LPS组和LPS+PEI组的细胞平均荧光光度值分别为221.0±11.2、228.0±8.2，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3　讨论

内毒素的生物学活性多种多样，在体内的作用错综复杂，参与了机体内许多病理生理反应过程。内毒素进入机体后，主要由单核/巨噬细胞识别、吸附。据报道，给大鼠静脉注射放射性标记的内毒素后5 min，99%以上的内毒素即迅速从循环中清除。免疫组化结果显示，从循环中清除的内毒素迅速分布到肝、肺、肾等组织的巨噬细胞内。内毒素及其代谢产物经巨噬细胞代谢后可逐渐由胆道系统排泄。所以说，单核/巨噬细胞在脓毒症的发生发展过程中发挥了极其重要的作用[8]。

内毒素进入机体内，对机体所造成的影响主要包括以下几个方面：①细胞水平：刺激单核/巨噬细胞、内皮细胞和白细胞等炎症细胞合成、释放一系列炎症介质，导致机体炎症反应失衡，从而造成细胞组织器官损伤。②免疫系统：导致固有免疫细胞和适应性免疫细胞如CD4、CD8、T细胞、B细胞和树突状细胞数量下降，细胞上抑制性受体(如程序性细胞死亡受体)表达增多，同时抑制性细胞(如调节性T细胞和髓源性抑制性细胞)明显升高。③凝血系统：激活凝血、纤溶系统，触发弥散性血管内凝血(DIC)等反应。④病理生理改变：发热反应、血压降低、代谢改变和局部过敏反应等[9]。目前认为，这些效应主要是由于LPS与巨噬细胞表面的受体结合后产生的刺激作用，促使炎症信号由细胞外转入细胞内，导致细胞合成、释放大量细胞因子及炎症介质，从而造成机体内炎症反应失衡。

LPS是由类脂、多糖、蛋白质组成的复合物，在结构上分成三部分：外层为O-特异性多糖链，为细菌的特异性抗原；中层为核心多糖，为细菌的共同的抗原；内层为类脂A，主要决定LPS的致病性，是LPS的生物活性中心。LPS在LPS结合蛋白LBP的运输下与CD14结合。CD14是一种55 kD的富含亮氨酸重复序列的糖蛋白，其在N端有一疏水口袋，该疏水口袋边缘富阳离子残基，能容纳磷酸化的脂质A，从而与LPS结合。CD14是GPI锚定蛋白，并没有细胞质内组分。为了将LPS信号转导入细胞内，CD14将LPS运送到TLR4-MD-2复合物，LPS促进TLR4-MD-2复合物二聚体的形成，进而促进细胞内信号的进一步传导；LPS刺激RAW264.7细胞后，导致大量促炎因子的产生，如TNF-α、IL-6等，其中有代表性的就是TNF-α。大量炎症介质的产生会对机体造成损伤，出现脓毒性休克甚至死亡[10～13]。在炎症早期积极地应用抗炎药物，能够抑制RAW264.7细胞的促炎反应，从而在一定程度上抑制全身炎症反应综合征。所以，对严重脓毒症或脓毒性休克更需要早期认识、早期诊断，并在诊断明确后立即治疗，只有这样才能改善预后[14，15]。

PEI是富阳离子的聚合物，常用于基因转染、免疫佐剂、基因疫苗运输工具，能够与LPS结合，吸附液体内游离的LPS[16,17]。本研究结果显示，LPS刺激巨噬细胞后，TNF-α在mRNA和蛋白水平均明显升高，应用PEI干预后，巨噬细胞产生的TNF-α下降。表明在LPS刺激RAW264.7细胞后，及早应用PEI能够有效抑制促炎介质的产生。富含阴离子的LPS能与富含阳离子的PEI结合，但我们的实验显示，在LPS孵育RAW264.7细胞10 min后加入PEI，与RAW264.7细胞结合的LPS数量并没有减少，也就是说PEI并不是通过抑制RAW264.7细胞与LPS的结合来抑制炎症反应的程度。

综上所述，PEI能够在LPS刺激引起的炎症反应早期抑制炎症反应的程度，为临床早期抗炎方案提供了新的思路，其具体作用机制及其在临床上的可行性仍需要进一步探讨。

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