靶向抑制Livin表达对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响

王晓华，张玉娟

(承德医学院附属医院，河北承德067000)

子宫内膜癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率及病死率呈上升趋势[1]。子宫内膜癌患者早期多表现为阴道异常出血，手术治疗预后较好[2]。但晚期或复发性内膜癌患者的预后仍较差，中位生存期不超过1年[3]。目前，针对肿瘤基因通路的分子靶向治疗是研究的热点[4]。Livin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成员，在人类胎盘组织以及大多数实体肿瘤细胞中特异性高表达，并与肿瘤的发生、发展关系密切[5]。研究[6]发现，Livin在子宫内膜癌组织中同样异常高表达，并且与组织学分级和肌层浸润有关。但是，关于Livin对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响鲜有报道。2015年12月～2017年2月，我们通过靶向抑制Livin在子宫内膜癌细胞中的表达，观察Livin对细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响，旨在为子宫内膜癌的分子靶向治疗提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料

人子宫内膜癌Ishikawa细胞购自南京凯基生物有限公司；胎牛血清(FBS)、RPMI1640培养基、PBS、胰酶购自美国Gibco公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；TRIzol购自美国Ambion公司；Takara RNA PCRTM逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；SYBR Green qPCR SuperMIX-UDG荧光定量试剂盒购自美国Invitrogen公司；细胞毒性-增殖检测试剂盒(CCK-8试剂盒)购自中国北京庄盟生物公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；特异性小分子干扰RNA(Livin-siRNA)及阴性对照序列(Livin-NC)由广州锐博公司设计合成。

1.2　细胞培养与分组处理

将Ishikawa细胞置于含10% FBS的RPMI1640培养基中常规培养。转染前24 h将细胞均匀接种于6孔板，调整细胞密度为4×105/mL。按Lipofectamine 2000说明书配制转染试剂。将细胞分为Livin-Si组、Livin-NC组和空白对照组，Livin-Si组转染Livin-siRNA干扰序列，Livin-NC组转染Livin-NC阴性对照序列，空白对照组加入10% FBS。转染6 h后弃去原培养基，更换为含10% FBS的完全培养基继续培养。

1.3　细胞中Livin mRNA表达检测

采用实时荧光定量PCR法。转染后48 h取各组细胞，加入TRIzol试剂提取RNA。逆转录合成cDNA。使用SYBR Green qPCR SuperMIX-UDG荧光定量试剂盒进行目的基因Livin和内参基因GAPDH的RT-PCR扩增反应，目的基因Livin和内参基因GAPDH的引物均由大连宝生物公司设计合成。Livin上游引物5′-ACGGAGCATGCCAAGTGGT-3′，下游引物5′-CTGCACACTGTGGACAAAGTCTCT-3′，扩增产物78 bp；GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，扩增产物138 bp。反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40个循环，95 ℃ 1 min、60 ℃ 30 s、95 ℃ 30 s进行熔解曲线分析。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.4　细胞增殖能力观察

采用CCK-8法。取对数生长期细胞，调整细胞密度至4×104/mL，接种于96孔板。培养24 h后进行细胞转染，每组设5个复孔，同时设置调零孔，只加培养基不加细胞。于转染24、48、72、96 h分别加入CCK-8稀释液20 μL(CCK∶无血清培养基=1∶1)，混匀，置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育2 h。使用酶标仪测定450 nm处吸光度OD值。

1.5　细胞侵袭能力观察

采用Transwell小室实验。应用Corning的小室模型，将Matrigel基质胶与无血清培养基按1∶5比例混匀，每个小室100 μL均匀包被小室基底膜。Matrigel基质胶凝固后，上室加入无血清培养基水化基底膜30 min。收集转染48 h的Livin-Si组、Livin-NC组和空白对照组细胞，PBS洗2次后，0.25%胰酶消化，用无血清培养基重悬，调整细胞密度至4×105/mL。每孔上室加入100 μL单细胞悬液，下室加入600 μL含20% FBS培养基，将小室放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养43 h。擦净Matrigel基质胶和上室的细胞，4 ℃预冷的甲醇固定30 min。用0.1%结晶紫染色20 min，PBS洗3遍；取下微孔滤膜，放到载玻片上，用二甲苯稀释过的树胶封片。显微镜下随机观察5个视野细胞数量计数，取平均值，实验重复5次。

1.6　细胞迁移能力观察

采用Transwell小室实验。不用铺Matrigel基质胶，CO2培养箱中培养时间为30 h，其余同Transwell小室侵袭实验。

1.7　统计学方法

2　结果

2.1　三组Livin mRNA表达比较

Livin-Si组、Livin-NC组和空白对照组Livin mRNA相对表达量分别为0.462±0.086、0.925±0.023、1.000±0.000。Livin-Si组Livin mRNA相对表达量较Livin-NC组和空白对照组降低(P均<0.01)。

2.2　三组细胞增殖能力比较

转染后24 h各组细胞OD值比较无统计学差异(P均>0.05)。转染后48、72、96 h，Livin-Si组细胞OD值低于Livin-NC组和空白对照组(P均<0.01)。见表1。

表1　三组细胞增殖能力比较

注：与Livin-Si组同时点比较，*P<0.01。

2.3　三组细胞侵袭能力比较

Livin-Si组、Livin-NC组和空白对照组穿膜细胞数分别为(22.4±3.6)、(52.6±4.2)和(54.8±2.8)个，Livin-Si组穿膜细胞数较Livin-NC组、空白对照组减少(P均<0.01)。

终于那个人不走，她的手摆在金枝眼下。女人们也越集越多，把金枝围起来。她好像在耍把戏一般招来这许多观众，其中有一个三十多岁的胖子，头发完全脱掉，粉红色闪光的头皮，独超出人前，她的脖子装好颤丝一般，使闪光的头颅轻便而随意地在转，在颤，她就向金枝说：

2.4　三组细胞迁移能力比较

Livin-Si组、Livin-NC组和空白对照组穿膜细胞数分别为(34.8±3.8)、(60.8±5.2)和(62.4±4.4)个，Livin-Si组穿膜细胞数较Livin-NC组、空白对照组减少(P均<0.01)。

3　讨论

细胞增殖与凋亡失衡是恶性肿瘤形成的重要机制之一。Livin位于20号染色体q13.3，全长4.6 kB，包含7个外显子和6个内含子。Livin的高级结构由4个α螺旋和一个反平行β折叠的氨基酸重复序列组成，此氨基酸重复序列称为高度保守杆状病毒IAP氨基酸重复序列，C端含有RING环指结构域。Lopes等[7]研究证实，Livin在正常成人的大多数组织中不表达或较少表达，在人的胎盘组织、胚胎组织以及大多数实体肿瘤中特异性高表达。Ye等[8]研究发现，Livin在前列腺癌组织中高表达，并通过调节细胞G1/S期促进细胞增殖，推测Livin可能在前列腺癌的发生及细胞增殖方面起重要作用。庄莉等[9]研究表明，抑制Livin基因可明显抑制肺腺癌SPC-A1细胞的增殖能力并增加细胞对顺铂化疗的敏感性。Vucic等[10]研究表明，Livin可明显促进Jurkat T淋巴细胞增殖，抑制其凋亡，其抗凋亡作用明显强于B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)。Crnkovic-Mertens等[11]在宫颈癌Hela细胞中利用小分子RNA特异性干扰Livin的表达，Hela细胞的生长明显受到抑制。Temkin等[12]研究发现，Livin在良性子宫内膜组织中少量表达，在子宫内膜癌组织中特异性高表达，并与组织学分级有关，与临床分期和淋巴结转移无明显相关性。本研究首先将Livin的小分子干扰RNA转染人子宫内膜癌Ishikawa细胞，实时荧光定量PCR检测转染后Livin mRNA表达量降低，说明成功抑制Livin在Ishikawa细胞中的表达。CCK-8实验结果显示，干扰Livin表达后，Livin-Si组细胞缺乏指数生长特征，增殖能力明显受到抑制。

Chung等[13]应用RNA干扰技术，通过免疫组织化学、RT-PCR、Western blotting技术检测胃癌AGS和SNU638细胞中Livin的表达，发现干扰Livin后能显著抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力。Myung等[14]研究Livin对大肠癌SW480和DK01两种细胞生物学行为的影响时发现，应用RNA干扰技术抑制Livin基因的表达，可显著抑制两种大肠癌细胞的浸润和转移能力，而过表达Livin则可促进细胞的侵袭和转移能力。Wang等[15]应用小分子RNA干扰技术观察肝癌HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭能力，结果显示敲除Livin后肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力均明显受到抑制。本研究侵袭及迁移实验结果显示，干扰Livin表达后，与Livin-NC组、空白对照组比较，Livin-Si组穿膜细胞数减少，说明Livin在子宫内膜癌的侵袭转移中发挥了重要作用，干扰Livin表达可抑制子宫内膜癌细胞的侵袭及转移能力。

综上所述，抑制Livin在子宫内膜癌Ishikawa细胞中的表达，可明显抑制细胞的增殖能力，减弱细胞的侵袭及迁移能力。Livin基因作为IAP家族中的一员，在子宫内膜癌的发生和侵袭转移过程中发挥了重要作用，相信随着研究的不断深入，一定能为子宫内膜癌的靶向治疗开拓新的方向。

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