Ad-HBV4.1在人肝癌细胞株HepG2中的复制情况及在BalB/C小鼠肝细胞中的表达观察

张媛媛

( 四川省中西医结合医院，成都610041)

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的以肝脏病变为主的一种传染病，主要临床表现为食欲减退、恶心、上腹部不是、肝区痛、乏力等，随病情进展可发展成肝硬化，少数可发展为肝癌。近年来，乙型病毒性肝炎的发病率逐年增高。探索具有实际应用价值的HBV感染模型或功能基因表达模型，加快HBV致病机理探讨、抗病毒药物筛选和疫苗研究等进程，是当今乙型肝炎防治研究的重大课题。腺病毒载体是常用的病毒转染载体，基因转染效率高。含1.3拷贝的HBV复制水平高，是常用的实验室HBV片段。目前关于腺病毒介导的HBV在体内外的复制、表达情况相关报道较少。本研究构建复制型HBV重组腺病毒Ad-HBV4.1[1～4]，观察其在HepG2细胞中的复制情况及在BalB/C小鼠肝细胞内的表达情况，为建立高效复制的HBV细胞模型和动物模型奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物、细胞、试剂及仪器 人胚肾细胞系HEK293，人肝癌细胞株HepG2、HepG2.2.15，由四川大学肝病实验室惠赠；雄性BALB/C小鼠30只购自四川大学实验动物中心；质粒DNA抽提纯化试剂盒购自QIAGNE公司；鼠抗-HBs多克隆抗体、兔抗-HBc多克隆抗体、辣根酶标记标记的羊抗兔-IgG、辣根酶标记标记的马抗鼠-IgG、链亲和素标记的辣根酶购自北京中杉生物工程有限公司。

1.2 Ad-HBV4.1的构建及感染复数测算 取适量HEK293细胞，37 ℃解冻、融化，含10%小牛血清的DMEM高糖培养基培养传代。从含1.3拷贝HBV DNA片段的质粒pTh-HBV4.1中，通过NotⅠ和KpnⅠ酶切获取HBV4.1片段，插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中，构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-HBV4.1。将pAdTrack-HBV4.1线性化后在大肠杆菌BJ5183内与骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组，形成pAd-HBV4.1。将pAd-HBV4.1用pac Ⅰ酶切后用脂质体2000转染至HEK293细胞进行包装和扩增，获得Ad-HBV4.1，将病毒液Ad-HBV4.1感染90%融合的HEK293细胞，培养细胞，反复冻融4次裂解细胞，收集含Ad-HBV4.1的上清。扩增72 h时荧光显微镜下观察HEK293细胞中Ad-HBV4.1的荧光情况。采用聚乙二醇法浓缩Ad-HBV4.1，所有操作均严格按照使用说明书进行。用终点稀释法计数荧光数测定病毒的滴度。将HEK293细胞以1×104/孔密度接种96孔板(100 μL/孔)，加入培养液做10-3～10-10系列稀释，每一稀释度占用一行，每一行的第1～10孔加入100 μL病毒稀释液，第11、12孔加入100 μL 培养基作为对照。培养24 h时在荧光显微镜下计数第1～10各孔发绿色荧光的细胞数，计算病毒滴度。病毒滴度(efu/mL)=发绿色荧光的细胞数×病毒稀释倍数/0.1 mL。用感染复数(MOI)试验测算感染细胞需要相应MOI的病毒液体积。

1.3 Ad-HBV4.1感染的HepG2细胞复制情况观察 ①采用免疫组化法检测Ad-HBV4.1感染的HepG2细胞中HBsAg、HBcAg 取MOI为100的Ad-HBV4.1感染HepG2细胞。转染72 h时后荧光显微镜下观察，约有90%以上的细胞GFP表达阳性。所有操作均严格按照使用说明书进行。显微镜下观察Ad-HBV4.1感染的HepG2、HepG2细胞HBsAg、HBcAg表达。HBcAg胞质为棕黄色或胞质含有棕黄色颗粒信号的细胞为HBsAg阳性细胞；胞质或胞核为棕黄色或胞质含有棕黄色颗粒信号的细胞为HBcAg阳性细胞。细胞之间染色强度相同，且累积一片细胞，提示反应为非特异性。切片边缘、刀痕或皱褶区域的细胞区，不能判为阳性。②采用Southern吸印杂交法检测细胞HBV DNA复制中间体取适量d-HBV4.1感染的HepG2细胞、HepG2细胞，提取细胞HBV DNA复制中间体，电泳后用毛细管法转印至尼龙膜，以地高辛标记探针预杂交及杂交过夜，化学发光法检测复制中间体[5]。

1.4 Ad-HBV4.1在BalB/C小鼠肝细胞内的表达情况观察 取BalB/C小鼠30，分为5组，每组6只。一组1 mL的Ad-HBV4.1 (约108efu/mL)尾静脉普通注射，注射时间>15 s；二组1 mL的Ad-HBV4.1 腹腔注射。三组10 μg的pHBV4.1片段用1.8 mL生理盐水稀释，尾静脉高压5～8 s内完成注射。四、五组分别采用生理盐水1.8 mL尾静脉、腹腔注射。注射第3 d处死三组小鼠，注射第1、3、5 d处死其余各组小鼠，取出肝组织，福尔马林固定24 h，脱水、透明、包埋，4 μm连续切片，80 ℃烘干备用。采用免疫组化法检测各组小鼠肝组织HBcAg,所有操作均严格按照使用说明书进行。染色后细胞胞质和/或胞核染色中存在棕黄色颗粒的提示存在HBcAg表达。

2 结果

扩增72 h时，显微镜下可观察到HEK293细胞胞质存在绿色荧光。40倍镜下可见“彗星”样的汇聚中心；100倍镜下可见细胞肿胀稍变圆，细胞核增大，折光性增强，并逐渐呈漂浮生长。培养24 h时Ad-HBV4.1病毒滴度为2.6～3.2×108efu/mL。

2.1 Ad-HBV4.1感染的HepG2细胞复制情况 感染72 h时，Ad-HBV4.1感染HepG2的细胞胞质中存在绿色荧光。200倍镜下可见细胞核增大，折光性增强。

Ad-HBV4.1感染的HepG2胞质中存在HBsAg表达，阳性率达90%以上,HepG2细胞胞质中未见HBsAg表达。Ad-HBV4.1感染的HepG2胞质中存在HBcAg表达，阳性率达90%以上,HepG2细胞胞质中未见HBcAg表达。

转染72 h时，HepG2细胞中未能检测到HBV DNA复制中间体；Ad-HBV4.1感染的HepG2细胞中存在HBV DNA复制中间体。

2.2 Ad-HBV4.1在BalB/C小鼠肝细胞内的表达情况 第1、3 d时一组小鼠肝组织中未见HBcAg，第5 d小鼠肝组织中可见HBcAg；各时段二组小鼠肝组织均未见HBcAg表达；第3 d三组肝组织中可见HBcAg；各时段四、五组小鼠肝组织均未见HBcAg表达。

3 讨论

目前研究HBV的细胞模型主要分为两种:①HBV感染细胞模型。即直接用含HBV的血清去感染原代肝细胞(原代肝细胞多取自肝活检或通过对肝脏进行门静脉灌注而获得)。但原代肝细胞来源有限, 肝内成分有易变性, 其应用受到限制。② HBV转染细胞模型。主要是通过DNA-磷酸钙共沉淀、电穿孔技术、病毒载体、脂质体介导等方法将HBV及其基因片段导入靶细胞中，可获得HBV DNA基因组的复制和表达。目前应用最多的是将携带有HBV DNA的质粒转染至细胞中，有报道转染同一质粒，脂质体法转染至HepG2细胞的转染效率较DNA-磷酸钙共沉淀法高25%～33%，而脂质体法转染质粒至HepG2细胞的效率大多为40%～60%，效率仍不是很高[5,6]。

在体内模型里,应用较多的是小鼠模型，包括①转基因小鼠 研究[7]显示HBV1.3转基因小鼠体内的病毒复制水平最高，可检测到各种病毒复制中间体和RNA。但转基因小鼠与自然感染病毒不同,不能检测到cDNA，故不能用于研究病毒进入和病毒扩散及抗病毒药物对病毒的清除作用等。②HBV感染小鼠 重组腺病毒载体介导的病毒感染模型:Sprinzl等[8]利用Ad-DHBV1.3系统,将重组腺病毒接种小鼠,5 d后在其肝脏及血清中均可检测出复制型DHBV。说明DHBV可以通过腺病毒转移到小鼠肝脏并支持DHBV体内复制。高压注射HBV DNA导致的病毒感染模型:给小鼠尾静脉短时间注射目的基因后,在其肝脏中检测到基因表达产物。孟忠吉等[9～11]采用高压水注射方法,通过尾静脉将具有复制能力的HBV质粒导入小鼠体内，发现HBV基因可在小鼠体内表达和复制。③人鼠嵌合肝动物模型：免疫缺陷鼠具有一种或多种免疫系统组成成分的缺陷,不能引发因人和鼠MHC-I抗原不同所致的排斥反应, 使得异种移植物存活成为可能。但该模型中人肝细胞的存活数量较少,而且其建立需要较严格的技术[12,13]。

从上世纪九十年代腺病毒就开始作为基因治疗的有效载体。腺病毒载体最大的优点之一就是可在包装细胞内高滴度复制，可感染多种分裂期和非分裂期细胞。第三代腺病毒载体，也叫假病毒或辅助依赖性腺病毒。这类腺病毒载体缺少病毒外壳蛋白，所以免疫原性大大降低，而且导入基因表达时间长，这类E1区缺失的腺病毒载体在293细胞或其它E1区互补的包装细胞系内复制。腺病毒载体作为目前最常用的生物治疗载体之一具有包装容量大、感染效率高、外源基因表达水平较高且相对较安全等优点。

本实验室结合腺病毒载体基因转染效率高和1.3拷贝HBV复制水平高的优势，利用一种改良的细菌内同源重组制备腺病毒的方法，已构建了含1.3拷贝HBV DNA片段(HBV4.1)的重组腺病毒Ad-HBV4.1。本研究将已构建好的复制型HBV重组腺病毒Ad-HBV4.1在HEK293细胞中大量扩增，并通过聚乙二醇方法浓缩病毒，得到滴度为2.6～3.2×108efu/mL的重组腺病毒，从而为进一步感染细胞和小鼠提供可能。

本研究选择HepG2作为靶细胞，用Ad-HBV4.1感染HepG2细胞构建HBV的体外模型。因Ad-HBV4.1携带有绿色荧光蛋白基因，在感染HepG2细胞后72 h，我们可以在荧光显微镜下观察到HepG2细胞胞浆发绿色荧光，且发绿色荧光的细胞达90%以上，感染效率较高。同时取细胞爬片，分别进行免疫组化HBsAg、HBcAg染色检测，均可见表达，提示HBV感染HepG2细胞后，能很快地进行转录并表达产生HBV特异性抗原。且HBsAg、HBcAg染色的阳性率达90%以上。通过Southern吸印杂交方法可检测到HBV DNA复制中间体，提示HBV可通过逆转录产生HBV复制中间体DNA。这说明本实验室构建的Ad-HBV4.1可以在体外感染靶细胞，并可进行HBV的复制,以及目的基因的正确表达。

以腺病毒为载体将具有复制能力的HBV基因组导入HepG2细胞与将HBV重组复制型质粒pHBV4.1转染至HepG2细胞构建的HBV体外模型相比，后者建立模型的细胞筛选工作较为繁琐，周期较长，且转染效率更低。而将HBV基因组插入腺病毒基因组中，借助腺病毒的感染过程很容易把HBV基因组转入宿主细胞，极大地提高了转染效率，也使转染过程更加稳定。

携带有HBV基因的重组腺病毒通过腹腔注射或者静脉注射均可在肝脏表达目的基因，而本研究用Ad-HBV4.1通过腹腔注射和尾静脉注射两种方式同时感染BalB/C小鼠，分别在第1、3、5天处死小鼠，取出小鼠肝组织，进行免疫组化HBcAg染色显示仅尾静脉注射第5天者为阳性，其余均为阴性。提示通过重组腺病毒作为载体将HBV导入小鼠体内，可在小鼠体内感染，并进行目的基因的正确表达。而相同的重组腺病毒滴度情况下，通过尾静脉注射的方式到达肝脏这一靶器官的病毒浓度高于腹腔注射的方式，更容易构建成功HBV的感染模型。

研究[13]证实通过高压注射体内转染法可构建急性HBV感染的小鼠模型，且在第3天目的基因的表达最强。它的基本原理是通过小鼠尾静脉快速注入大容量的质粒DNA溶液，造成小鼠短暂的心衰，使液体由下腔静脉经肝静脉迅速返流入肝脏，使得DNA未能与血清中的核酸酶有效接触就进入了肝细胞。本研究通过重组腺病毒载体介导的方式也可成功第5天开始在小鼠模型中观察到HBV表达，时间较高压注射体内转染法晚，本模型HBV表达持续时间是否较高压注射体内转染法更长，还需进一步的研究。尾静脉高压注射，可因为一次性高容量的注射对小鼠肝脏可能造成一定的损伤,以及可能增加的心脏负荷甚至导致小鼠死亡的可能。而本模型注射的途径是直接通过小鼠尾静脉普通注射，无需外科手术和特殊的设备装置，却达到了和尾静脉高压注射相似的效果，所以该模型的建立简单、方便、安全。

综上所述，Ad-HBV4.1感染HepG2细胞成功建立HBV复制与表达的体外模型，感染效率达90%以上，可见HBsAg、HBcAg及HBV DNA复制中间体表达。Ad-HBV4.1尾静脉注射BalB/C小鼠肝组织存在HBV表达。