Shh信号通路在大脑皮质发育畸形发生发展中的作用机制研究进展

刘美，邓萍萍 ，马勋泰

(西南医科大学附属医院，四川泸州 646000)

皮质发育是一个非常复杂的过程，主要包括神经干细胞的自我更新、分化、迁移、成熟等步骤，其中涉及许多信号通路的激活。由于发育信号级联过程中的异常则可导致严重的先天性异常，如皮质发育畸形(MCD)。MCD是由于皮质发育过程中某些基因或蛋白发生突变或异常而引起的，是难治性癫痫的主要病因。MCD是一组疾病，包括局灶性皮质发育障碍、前脑无裂畸形(HPE)、室周异位症(PH)、小头畸形(MCPH)、巨脑回畸形、无脑回畸形等。目前人们已发现mTOR信号通路、MAPK信号通路、TGF-β信号通路、Wnt信号通路、Reelin信号通路，以及最近备受关注的Sonic hedgehog (Shh)信号通路[1]等多条信号通路与大脑MCD有关。mTOR信号通路抑制剂雷帕霉素[2]等已应用于动物实验及临床，证明其能改善MCD的病理及临床表现。Shh信号通路与皮质发育障碍密切相关。Shh基因编码的Shh蛋白是多种组织器官发育所必需的，包括中枢神经系统、泌尿生殖系统、呼吸系统、消化系统、四肢和眼睛等[3]。在中枢神经系统中，Shh信号通路与HPE、PH、MCPH、Feingold 综合征、Jouber综合征(JS)密切相关。现将Shh信号通路在大脑MCD发生发展中的作用机制相关研究进展综述如下。

1 Shh信号通路

果蝇刺猬(hh)基因是1980年在对果蝇发育研究过程中发现的一种基因，哺乳动物体内有3种hh同系物：Shh、Desert Hedgehog(DHH)、Indian Hedgehog(IHH)[4]，分别编码Shh、Ihh和Dhh蛋白。 Shh与脑、脊髄、肺脏、肾脏、毛发、面部和四肢等多种器官的形态形成有关，与肿瘤的发生有关[5]。

Shh信号传导通路由Shh、Patched(Ptc)、Smoothened(Smo)、丝氨酸/苏氨酸激酶(Fu)、Fu抑制剂(SuFu)、类运动蛋白 (Cos2)、蛋白激酶A(PKA)及下游的锌指转录因子Gli蛋白组成。Ptc由抑癌基因编码，是由12个跨膜区的单一肽链构成，是Shh的受体，在没有配体结合的情况下，抑制Smo的活性，对Shh信号起负调控。 Smo由原癌基因编码，是一个7次跨膜的G蛋白偶联受体，N端位于细胞外，C端位于细胞内，跨膜区氨基酸序列高度保守，C 末端的丝氨酸与苏氨酸残基为磷酸化部位，蛋白激酶催化时结合磷酸基团，其磷酸化水平改变核转录因子的活性状态[6]。Smo是Hh信号传递所必须的受体。在无Hh、Ptc的情况下，激活Smo可导 致Hh 靶基因的活化；基因Smo突变时，可出现与Hh 基因突变相同的表征。其中Ci/Gli、Fu起正调控作用，Cos 2、PKA起负调控作用。Gli蛋白家族成员是较大的多功能的转录因子，属于C2 H2型锌指结构蛋白。Gli蛋白是一种多功能转录因子，脊椎动物中Gli至少由Gli1、Gli2、Gli3 3种成分组成，Gli1、Gli2主要起转录激活作用，Gli3起转录抑制作用[7]。

Shh信号通路主要包括胞膜部分、胞质和胞核三部分，当不存在hedgehog配体时，胞膜上的Shh受体Ptc将抑制Smo的活性，Smo无法将Shh信号向胞内传导，胞浆内Gli与一些蛋白如Fu、cos2、Sufu在微管上结合形成复合物，Gli被蛋白酶水解为非活性形式导致其下游的转录受到抑制。当hedgehog与Ptc结合时，Smo上的抑制效应被解除，处于激活状态的Smo聚集在初级纤毛上并引起Cos2和Fu过度磷酸化，导致复合物从微管上解离，Gli的蛋白水解被抑制，其以活性形式进入细胞核，进入细胞核以后Ciact与CREB结合蛋白(CBP)结合并激活Shh靶基因，以维持胚胎发育、促进自我更新、血管生成等多种生物学活性[5]。

Shh基因及其信号通路在胚胎的发生、发育中起重要作用，涉及许多器官的发育及成体组织稳态的各个方面。在神经系统的作用主要包括两个方面，一是对神经系统发育的诱导作用，二是对神经系统肿瘤形成的影响。它介导细胞增殖、分化和凋亡等重要发育过程。

2 MCD的发病机制

MCD的解剖和组织学亚型取决于影响大脑正常发育失败的时刻及损伤的严重程度或遗传异常。其发病机制主要包括：①遗传因素，如染色体异常、基因突变等；②物理化学损伤，包括电离辐射、酒精、饮食等；③感染，包括病毒或细菌的感染，如巨细胞病毒、寨卡病毒等；④其他。MCD是一组有着高度临床表现异质性和致残性的疾病，是神经系统发育迟缓和癫痫的常见原因，尤其是难治性癫痫，据估计，高达40%的难治性癫痫患儿有MCD[8]。多数MCD可通过中等-高分辨MRI检查进行区分。MRI上的关键特征包括MCD的分布部位及严重程度、皮质表面情况、灰白质之间的界限、皮质厚度及相关脑部畸形等。

根据皮质发育的过程可将MCD形分为三大类：Ⅰ组神经元和神经胶质增殖或凋亡有关的畸形，包括MCPH，巨脑症等；Ⅱ组神经元异常迁移有关的畸形，如无脑回畸形、鹅卵石样畸形等；Ⅲ组皮质组建异常有关的畸形，如多小脑回畸形、局灶性皮质发育障碍(FCD)等[9]。其中国际抗癫痫联盟(ILAE)在2011年报告了一个三级分类系统，将局灶性皮质发育障碍分为FCDI型：神经元迁徙及成熟异常导致的皮层分层异常的皮质畸形。FCDII型表现为皮层分层异常和异性神经元的皮质畸形。FCD Ⅲ型表现为皮层异常伴其他临近组织病变[10]。

3 Shh在MCD发生发展中的作用机制

3.1 Shh在HPE发生发展中的作用机制 HPE又称全前脑畸形，是胚胎发育过程中，前脑发育障碍引起的一组复杂的颅脑和面部畸形。HPE是一种遗传异质性疾病，其临床表现为极为严重的中枢神经系统及颜面畸形，常造成流产、死产或胎儿1 岁内死亡，新生儿存活率极低。HPE也可表现为临床症状较轻的脑畸形，导致患儿出现小头症、智力低下、癫痫等。HPE的病因尚不清楚，多数学者认为与环境和遗传因素有关。与 HPE 相关的遗传致病因素主要有单基因突变、基因组拷贝数目变异 (CNVs) 及染色体异常[11]。

Shh是最著名的导致HPE的基因，对诱导腹侧神经管的发育具有重要的作用。在Shh(-/-)小鼠模型中小鼠前脑、中腹侧结构不存在，大脑端脑结构无法分开，眼球不分离，形成一系列脑、脊索和颅面异常[12]，模拟了人类HPE的表型。Erich等[13,14]，证实了Shh的单倍体不足在人类中可引起HPE。另外有研究[15]使用Shh信号通路拮抗剂环巴胺及其有效类似物作用于孕鼠，其子代产生了唇裂、腭裂及HPE相关表型，环巴胺主要抑制Smo从而抑制了Shh信号传导。乙醇、视黄酸等HPE致畸剂由于消除了Shh信号传导从而产生前脑裂畸形一系列表型[16]。在HPE患者中也发现存在跨膜蛋白受体PTCH1基因突变[17]。Shh信号通路的下游效应因子Gli2的变异同样可以导致HPE，Gli2-/-可以导致脑部、面部畸形，而Gli2+/-可使实验动物对致畸因子引起的HPE的敏感性增加[18]。端脑和间脑的分离还取决于Shh与Gli3的相互作用[19]。Shh通过自切割产生N-端和C-端两个片段，Shh-N的末端共价结合一个胆固醇分子，有研究[20]在动物模型中给予胆固醇合成的抑制剂，同样导致了HPE样畸形。

3.2 Shh在PH发生发展中的作用机制 PH是最常见的MCD之一，主要临床表现为癫痫发作、智力低下和不同程度的精神运动发育迟缓，影像学主要表现为双侧侧脑室旁对称的连续或者不连续的结节状的异位灰质。83%～100%经典的家族性PH女性患者与细丝蛋白A(FLNA)基因突变有关。除FLNA基因之外，二磷酸腺苷基化因子鸟嘌呤核苷酸交换因子2 (ARFGEF2)基因以及多聚谷氨酰胺结合蛋白1(PQBP1)基因突变同样可以引起PH相同的表型。FLNA编码一种大型微丝结合磷酸化蛋白，可稳定细胞骨架，有利于脑室上皮局部黏附的正确形成。ARFGEF2基因编码BIG2，BIG2是蛋白激酶A锚定蛋白(AKAP)，其通过其Sec7结构域调节囊泡转运和从细胞内向细胞表面转运的过程[21]。Big2和FLNA相互作用调节整合素/桩蛋白在细胞膜的稳定性和周转，从而直接影响神经迁移。神经迁徙的机制之一为顶端脱离。损失FLNA或BIG2导致沿神经外膜各种细胞黏附相关蛋白如钙黏蛋白和桩蛋白的减弱表达[22，23]，可使顶端提前脱离，在脱离之前，Shh信号通过初级纤毛维持[24]。这个纤毛在转导Shh信号维持神经上皮细胞在增殖状态中发挥关键作用[25]，顶端脱离导致纤毛的解体，纤毛解体使 Shh信号传导丧失和与祖细胞离开细胞周期的增殖下降，从而参与异位结节的产生。低密度脂蛋白相关蛋白2(LRP2)编码巨蛋白。巨蛋白已被证明在前脑中螯合Shh，并介导Shh-Ptch内吞作用[26]。LRP2突变可影响Shh信号通路的传导，可解释LRP2突变患者中观察到的异常神经元定位。

3.3 Shh在MCPH发生发展中的作用机制 MCPH又称原发性小头症，是一组脑发育的常染色体隐性遗传性疾病。小脑症基因(MCPH1)、WD重复区域-62(WDR62)、细胞周期依赖蛋白激酶调节相关蛋白2基因(CDK5RAP2)、人类中心体蛋白152基因(CEP152)、非正常纺锤体样蛋白基因(SPM)、着丝粒相关蛋白基因CENPJ和SCL-TAL1干扰位点(STIL)等11个基因与MCPH的发生发展有关，并且其中大多数基因编码与有丝分裂纺锤体相关的中心体或中心体蛋白质[27]。MCPH临床主要表现为小头畸形和非进行性神经发育迟滞。在由ASPM基因突变导致的小头畸形患者中有较高频率的癫痫发作，但其他类型罕见[28]。研究[29，30]表明最近发现的MCPH基因SIL / STIL与Shh信号通路密切相关，已经通过免疫荧光显微镜确定STIL - / -小鼠胚胎缺乏中心粒和原发性纤毛，而Shh信号通路的激活和传导依赖于原发性纤毛的形成。STIL在细胞质中与SuFu相互作用以调节Shh信号，参与MCPH的形成[31]。

3.4 Shh在Feingold 综合征、JS发生发展中的作用机制 Feingold综合征是一种罕见的常染色体显性遗传病。它的特点是小头症、食管和十二指肠闭锁，常伴有学习障碍或智力迟钝，少数患者中还伴有肛门闭锁、椎体异常、心脏畸形和耳聋、肾囊性发育不良。Feingold综合征可分为1型和2型，均可表现为小头症、学习障碍或智力迟钝等。1型主要由癌基因MYCN突变引起，定位在2p24，2型在染色体13q31.3上发现有MIR17HG基因的半合子缺失。

研究[32]发现小鼠体内Shh突变及其下游效应因子Gli2和Gli3的改变可以导致气管、食道、肾、椎骨和心脏的异常，其中小头畸形反映背侧端脑的生长和发育减少。Shh-/- 小鼠可以具有前脑部分缺失的表征，这表明胚胎期腹侧端脑发育的紊乱，小鼠Gli3-/-也有异常发育的端脑。因此，Shh突变及其下游效应器的突变可导致在人和小鼠中与Feingold综合征各种畸形一致的表型。

JS是具有常染色体隐性遗传或X连锁遗传的先天性小脑共济失调，其诊断标志是头颅MRI中独特的小脑和脑干畸形“臼齿标志”。迄今为止，已经鉴定了21个致病基因，所有致病基因均可编码初级纤毛及其相关蛋白质，在脊椎动物中Shh信号通路许多核心成分，如Patched1(Ptch1)、Smoothened(Smo)、Sufu和Gli转录因子，均要定位于纤毛上，纤毛功能障碍可导致Shh通路严重破坏[5]。几个JS相关基因中的突变已经与Shh信号异常传导相关联，并且这些基因敲除的小鼠显示了一系列与Shh缺失相关的表型，包括一系列脑发育异常如神经管背部和闭合缺陷、脑畸形、后肢畸形等[33]。有研究[34]对人类JS胎儿样本进行分析发现，在不同基因突变引起的JS、MKS或Jeune综合征患者妊娠16周后，胎儿小脑颗粒祖细胞的增殖显著减少，同时与正常组相比Gli1 mRNA和Ptc蛋白水平降低或不可检测，表明Shh信号通路的异常与JS综合征小脑发育不良有关。

综上所述，MCD的发生、发展涉及许多信号通路的激活。Shh信号通路的异常在MCD的发生、发展中起重要作用，Shh途径的各种成分缺失将导致胚胎死亡或具有明显的畸形，基因敲除动物模型在研究Shh信号通路功能方面具有极大帮助。但目前关于Shh信号通路与MCD的关系仍未完全阐明，如Shh信号通路对不同类型皮质发育畸形的影响，其具体作用蛋白及调控机制，是否涉及其他信号通路的激活，同时Shh信号通路本身仍存在疑惑，如上游hh信号的产生及调节机制，Ptc究竟是通过何种机制对Smo进行调控，通路中磷酸化事件的具体作用等。