荧光定量PCR检测技术在结核诊断中的应用探讨

谭珂 孙炳奇 沈阳市第十人民医院（沈阳市胸科医院）结核病实验室 （辽宁 沈阳 110044）

结核属于临床常见疾病，结核分枝杆菌属于主要病原菌，其实验室检测当属诊断结核病及治疗转归比较重要的依据[1]。尽量提高检测水平，促进早诊断与早治疗，是有效控制结核病蔓延的主要方案[2]。细菌培养与涂片镜检是最为主要的实验室诊断方案，从有关研究报告中可以看出，传统培养方式周期过长，检出率较低[3]，无法满足临床需求。荧光定量PCR检测技术主要是利用PCR体外扩增法检测结核分枝杆菌DNA，是比较重要的一种基因诊断方法，有着特异性好、灵敏度高、污染少等特点[4]。为了进一步探讨结核诊断中应用荧光定量PCR检测技术的价值，本院将收治的120例结核患者进行研究，现将结果报道如下。

1.资料与方法

1.1 临床资料

本次研究共有对象120例纳入，全部是本院收治的结核患者，纳入时间2013年12月～2015年9月。120例患者中男性有73例、女性有47例；年龄20～83岁，平均（57.9±15.4）岁。所有患者临床资料完整，根据诊察需要，收集患者痰液、胸腹水、尿液等标本进行处理。

1.2 方法

所有患者标本均进行涂片查找抗酸杆菌，以及结核菌培养、结核分枝杆菌DNA检测等处理，根据涂片结果分为两组，其中涂阳结核30例为涂阳组，涂阴结核90例为涂阴组。针对结核分枝杆菌DNA阳性者再次进行耐药基因测定，涂阳组且结核分枝杆菌DNA阴性则实施非结核分枝杆菌菌种鉴定。

1.3 观察指标

对涂阳组与涂阴组检验结核分枝杆菌DNA阳性率进行记录与对比，同时观察记录结核分枝杆菌DNA阳性中耐药情况。

1.4 统计学分析

本次研究数据利用SPSS19.0分析，计数资料采取百分比（%）表示与χ2检验，将P＜0.05为统计学有意义。

2.结果

2.1 涂阳组与涂阴组结核分枝杆菌DNA阳性率、结核菌培养阳性率比较

涂阳组结核分枝杆菌DNA阳性率、结核菌培养阳性率均显著高于涂阴组（P＜0.05），见表1。

表1. 涂阳组与涂阴组结核分枝杆菌DNA阳性率、结核菌培养阳性率对比(n,%)

2.2 结核分枝杆菌阳性者耐药菌情况

结核分枝杆菌DNA阳性者64例，最终检出耐药7例，耐药率为26.56%，见表2。

表2. 结核分枝杆菌阳性耐药情况分析

3.讨论

结核属于常见疾病，主要是结核分枝杆菌感染所致，也是威胁人类生命健康最为主要的疾病之一。结核分枝杆菌传染源主要为排菌肺核患者，主要经呼吸道传播，健康人群感染后并不一定发病，但机体免疫力下降后则容易发病。从WHO相关统计报告中可以看出，全球每年结核病发生大约有800～1000万，且每年死于结核病的人次高达300万，是造成患者死亡最为主要的传染病。1993年WHO宣布“全球结核病紧急状态”，将其作为全球公共卫生问题，而我国属于结核病疫情最为严重的一个国家，需积极做好预防与治疗。结核诊断方式以结核病原学检测为主，该方法是发现结核分枝杆菌主要途径，方法较多，比如涂片查找抗酸杆菌、结核菌培养、结核分枝杆菌DNA检测等。

本院将收治的120例结核患者作为对象进行研究，均接受结核分枝杆菌DNA检测与结核菌培养及涂片查找抗酸杆菌，根据涂片查找抗酸杆菌结果分为两组，涂阳结核为涂阳组，涂阴结核为涂阴组，针对结核分枝杆菌DNA阳性者再次耐药基因测定，涂阳组且结核分枝杆菌DNA阴性则再次实施非结核分枝杆菌菌种鉴定，结果显示涂阳组结核分枝杆菌DNA阳性率、结核菌培养阳性率分别为93.33%、86.67%，涂阴组则依次为40.00%、10.00%，涂阳组均显著高于涂阴组（P＜0.05）；结核分枝杆菌DNA阳性中检出耐药株，包括单耐药和异烟肼利福平双重耐药，例数分别为4例、3例。传统涂片查找抗酸杆菌尽管操作性与及时性等有优势，但敏感性过低，且标本浓度达到10000条/mL才能测得阳性结果，可见特异性较差。近几年，培养法被认为是金标准，有高特异性与敏感性，但4～8周才能获得结果，检验周期过长，而且对于结核与非结核分枝杆菌菌种还要进一步鉴别与诊断。荧光定量PCR技术是利用一对结核分枝杆菌特异性引物、一条结核分枝杆菌特异性荧光探针，加上PCR反应液、四种核苷酸单体、耐热DNA聚合酶等，采取PCR扩增法测定结核分枝杆菌DNA水平。这种技术属于重要的基因诊断方法，不仅灵敏度高、特异性良好，而且能定量测定，污染更少，耗时更短，更标准。此外，荧光定量PCR技术在PCR反应体系中加入荧光基团，累积监测荧光信号，并监测PCR进程，经CT值、标准缺陷测定样品DNA或者cDNA，这种方式快速、准确，仅需1d便能获得检测结果。加上采取密闭状态下PCR扩增，使得扩增物无污染，减少假阳性结果，使得检查特异性与灵敏度明显提高。荧光定量PCR诊断结核分枝杆菌特异性与敏感性均较高，比抗酸涂片法更有优势，且和抗酸涂片阳性程度相关性良好，联合诊断能提高阳性菌诊断符合率，为临床诊治提供更可靠的依据。

综上所述，结核诊断中应用荧光定量PCR检测技术处理，对结核分枝杆菌DNA有较高的敏感性，检出率高，而且检查时间短，能及时发现耐药等情况，以便为临床治疗用药提供依据。

[1]王雅宁.荧光定量PCR技术检测结核杆菌临床应用分析[J].实用预防医学,2012,19(9):1404-1406.

[2]周稳兰,陆春芬,朱蔚岗,等.荧光定量PCR检测技术在肺结核诊断中的应用[J].江苏医药,2015,15(23):2874-2875.

[3]邬艳.荧光定量PCR检测痰结核杆菌特异性DNA序列及其临床应用[J].中外医学研究,2012,10(16):65-66.

[4]朱明利.荧光定量PCR对血及痰培养物中结核分枝杆菌DNA的检测[J].国际流行病学传染病学杂志,2010,37(3):145-148.