谢春,朱海东,马红英,李静
(商丘医学高等专科学校,河南商丘476100)
单纯性疱疹是单纯疱疹病毒感染引起的常见皮肤病,中医称为热疮。单纯疱疹病毒能造成人类多种皮肤、黏膜疾病,包括脑炎、角膜结膜炎、龈口炎、生殖系统感染等[1]。单纯疱疹病毒(HSV)是疱疹病毒科a病毒亚科重要的一员,病毒直径180 nm左右。医学科学上以其不同的抗原性分为1型和2型[2]。1型病毒主要侵犯口唇,2型主要侵犯生殖器。单纯疱疹病毒2型(HSV-2)传播途径主要为性接触传播,侵犯生殖器官引发炎症及疱疹[3]。HSV毒力产生的机制目前仍不十分清楚。感染HSV-2的人宫颈上皮细胞凋亡水平升高,是HSV-2毒力的直接体现。细胞自噬活性水平与细胞凋亡密切相关。干扰素β(IFN-β)、IL-6是重要的炎症因子,参与细胞的自噬过程。2017年1~11月,本研究观察了感染HSV-2对人宫颈上皮HCE细胞自噬活性和IFN-β、IL-6表达的影响,旨在探讨HSV-2对宫颈上皮细胞毒力的形成机制。
1.1 HCE细胞培养及分组处理 永生的HCE细胞系来自美国标准生物品收藏中心,培养于无血清的角质化细胞(含氯化钙)培养基,按需求添加适当微量元素,培养环境为37 ℃、5%CO2培养箱。将HCE细胞分为观察组和对照组,各7株。观察组在Vero细胞上增殖,然后采用Vero细胞病毒接种HSV-2,感染复数(MOI)为3,37 ℃感染1 h后去除接种物并更换新培养基继续培养,继续培养1、4、11、18、22 h后收集细胞及细胞上清液。对照组细胞正常培养,不感染HSV-2。
1.2 细胞自噬活性观察 ①免疫荧光法观察荧光强度:在收集到的细胞中用Lipofectamine 2000转染GFP-LC3Ⅱ质粒,试剂盒购自美国R&D公司,按试剂盒说明书操作。转染后继续培养12 h,油镜下观察并测量荧光强度。②Western blotting法检测LC3Ⅱ表达量。TRIzol法提取细胞总蛋白,然后用Western blotting法检测LC3Ⅱ表达量。试剂盒购自美国R&D公司,操作按试剂盒说明书进行。以β-actin为内参照,LC3Ⅱ表达量以LC3Ⅱ条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值表示。
1.3 细胞培养液上清IFN-β、IL-6检测 采用ELISA法检测IFN-β、IL-6。试剂盒购自美国R&D公司,操作按试剂盒说明书进行。
2.1 两组细胞荧光强度、LC3Ⅱ表达比较 感染HSV-2后观察组细胞荧光强度、LC3Ⅱ表达量迅速升高,与对照组相比,P均<0.05。观察组感染后4 h细胞荧光强度、LC3Ⅱ表达量均达到峰值。见表1。
2.2 两组细胞培养液上清液IFN-β、IL-6水平比较 感染HSV-2后观察组细胞培养液上清液IFN-β、IL-6水平迅速升高,与对照组相比,P均<0.05。观察组感染后4 h细胞培养液上清液IFN-β、IL-6水平均达到峰值。见表1。
表1 两组细胞荧光强度、LC3Ⅱ表达量及培养液上清液IFN-β、IL-6水平比较
注:与对照组比较,*P<0.05;与观察组其他时点比较,#P<0.05。
有报道[6]称患有生殖器疱疹孕妇分娩的新生儿罹患疱疹性脑炎以及全身性播散性疱疹的几率大大升高,且具有较高的病死率,存活婴儿可遗留严重后遗症。HSV-2还与宫颈癌的发生、发展具有一定的联系。HSV-2对女性以及孕期母婴的危害性极大,但临床上尚无特效药物治疗HSV-2感染。探讨HSV-2产生毒力的机制可以为抗HSV-2感染药物的开发指明方向,具有重要的临床意义[7]。
自噬相关蛋白LC3正常情况下分布于细胞质,为LC3Ⅰ。自噬发生时,LC3Ⅰ酶解掉一小段多肽转化为LC3Ⅱ,LC3Ⅱ主要分布于自噬体膜表面,故用免疫荧光法在转染GFP-LC3Ⅱ质粒后观察细胞荧光强度以及用Western blotting法检测细胞LC3Ⅱ表达量可以反映细胞自噬活性[8]。本研究结果显示,观察组HCE细胞感染HSV-2后,用免疫荧光法观察荧光强度升高,用Western blotting法检测LC3Ⅱ表达量发现LC3Ⅱ表达量也升高,说明感染HSV-2可以提高HCE细胞自噬活性,这可能是导致HCE细胞凋亡增加的机制。本研究结果还显示,观察组细胞感染HSV-2后细胞自噬活性迅速提高,但是到感染后4 h即达到峰值,与既往研究[9~12]中观点一致。结合文献,笔者认为观察组细胞感染HSV-2后细胞自噬活性迅速提高的机制是由于双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)被活化。而感染后4 h细胞自噬活性即达到峰值,而后逐渐下降是因为神经毒力蛋白(ICP~34.5蛋白)在感染后4 h左右开始表达,其与自噬蛋白Beclin1相发生互作用,可以产生抑制自噬的效果[13~17]。
本研究结果显示,观察组细胞感染HSV-2后细胞培养液上清IFN-β与IL-6表达升高,感染后4 h逐渐下降,其变化趋势与细胞自噬活性的变化趋势一致。文献报道,小鼠感染HSV-2后主要潜伏于神经节细胞,而IFN-β与IL-6阳性表达的细胞会聚集于感染HSV-2的神经节细胞周围[18~21]。结合本研究结果,笔者认为感染HSV-2后HCE细胞IFN-β、IL-6表达升高,这是细胞对感染HSV-2产生的免疫反应,IFN-β、IL-6参与了细胞自噬过程,是其中重要的效应分子。IL-6可刺激T细胞增殖、活化细胞毒性T淋巴细胞、刺激B细胞增殖并分泌抗体、刺激肝细胞合成急性期蛋白参加炎症反应[22~24]。IFN-β有直接抗病毒作用。考虑到T淋巴细胞和抗体诱导细胞凋亡过程中有细胞自噬机制参与其中,笔者推测IFN-β、IL-6表达升高对细胞自噬可能也有促进作用,二者的作用可能是相互影响的;但尚需进一步研究证实。
[1] Knipe DM. Nuclear sensing of viral DNA, epigenetic regulation of herpes simplex virus infection, and innate immunity[J]. Virology, 2015(480):153-159.
[2] 李艳芳,王运贤,黄雪梅,等.宫颈癌患者人乳头瘤病毒与巨细胞病毒和单纯疱疹病毒Ⅱ型感染的相关性研究[J].中华医院感染学杂志,2017,27(16):3757-3760.
[3] 李明远,马豫焕,王新荣.单纯疱疹病毒Ⅱ型诱导人宫颈上皮细胞上调细胞的自噬活性和表达水平的作用[J].广东医学,2016,37(10):1450-1455.
[4] 叶峻杰,马丽,赵树华,等.人乳头瘤病毒和单纯疱疹病毒2型及巨细胞病毒协同感染与子宫颈病变的关系[J].中华检验医学杂志,2013,36(3):238-241.
[5] 曹婷,邢怡桥,杨燕宁,等.Ⅰ型单纯疱疹病毒感染对人角膜上皮细胞基质金属蛋白酶-2和黏着斑激酶表达的影响[J].中华实验眼科杂志,2013,32(11):1050-1054.
[6] 阿尼克孜·阿不都艾尼,玛依努尔·尼牙孜.人乳头状瘤病毒、单纯疱疹病毒2型和巨细胞病毒感染与宫颈癌的相关性研究进展[J].现代生物医学进展,2012,12(4):742-745.
[7] Zhu Li, Xuan Lu, Yufan Zhu, et al. Lambda-interferons inhibit herpes simplex virus type 2 replication in human cervical epithelial cells through activation of JAK/STAT pathway[J]. Japanese Journal of Infectious Diseases, 2017,70(4).
[8] Li Z, Jie-Liang L, Yu Z, et al. Induction of interferon-λ contributes to TLR3 and RIG-I activation-mediated inhibition of herpes simplex virus type 2 replication in human cervical epithelial cells[J]. Molecular Human Reproduction, 2015,21(12):917-929.
[9] 毕建军,杨慧兰.单纯疱疹病毒2型与宫颈癌相关性的研究进展[J].实用医学杂志,2011,27(3):530-532.
[10] 丁芝祥,彭燕一,邱梅园,等.腺相关病毒介导HSV-tk/GCV系统对晶状体上皮细胞的旁观者效应及机制[J].眼科新进展,2012,32(8):708-711.
[11] 阮艳秋,刘伟平,殷明刚,等.乳头瘤病毒、单疱病毒感染及其与宫颈癌前病变的相关性分析[J].实用医院临床杂志,2014,11(6):115-117.
[12] Dipaolo JA, Woodworth CD, Coutlée F, et al. Relationship of stable integration of herpes simplex virus-2 BglII N subfragmentXho2 to malignant transformation of human papillomavirus-immortalized cervical keratinocytes[J]. International Journal of Cancer, 2015,76(6):865-871.
[13] 王小东,程钰,李宏松,等.单纯疱疹病毒性角膜炎对角膜表层上皮细胞的影响[J].陕西医学杂志,2016,45(10):1377-1379.
[14] 杨励,牛妍艳,刘杨,等.2型单纯疱疹病毒感染后HaCaT细胞分泌细胞因子的变化研究[J].哈尔滨医药,2017,37(4):301-303.
[15] 陈宏,陈群,齐鑫,等.疏风解毒胶囊对反复呼吸道感染急性发作患儿IFN-γ、IL-1β、IL-2和IL-4炎性因子的影响研究[J].北京医学,2016,38(10):1130-1132.
[16] 沈秉正,高翔,吴杰等.抗病毒药物治疗对带状疱疹患者血清细胞因子IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的影响[J].中华实验和临床感染病杂志(电子版),2017,11(4):326-329.
[17] 帅学宏,陈吉轩,施君,等.青蒿多糖对小鼠血清中IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ水平的影响[J].西南大学学报(自然科学版),2017,39(7):11-16.
[18] 高小平,冯丽萍,游武进,等.猪链球菌2型感染对TGFβ细胞凋亡蛋白表达的影响研究[J].中华医院感染学杂志,2016,4(4):721-723.
[19] 张松静,马祥祥,张科.奥曲肽联合硫酸奈替米星预防化脓性阑尾炎术后感染及对患者Th17/Treg失衡的影响[J].中国生化药物杂志,2017,14(4):351-353.
[20] 马运华,胡涛.HPV感染者血清细胞因子IL-2、IFN-γ和TGF-β水平及意义[J].菏泽医学专科学校学报,2017,29(1):23-24.
[21] 徐妍妍,周国平,徐华国.卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)vIL-6通过IRF-3负性调控IFN-β转录表达[J].病毒学报,2017,8(2):136-141.
[22] 陈晨,陈强,李岚,等.重组融合蛋白IL-18对金黄色葡萄球菌感染小鼠免疫相关炎症因子表达的影响[J].中国当代儿科杂志,2017,19(6):705-711.
[23] Pandey N, Jain A, Garg R K, et al. Serum levels of IL-8, IFNγ, IL-10, and TGF β and their gene expression levels in severe and non-severe cases of dengue virus infection.[J]. Archives of Virology, 2015,160(6):1463-1475.
[24] Wang JB, Li H, Wang LL, et al. Role of IL-1β, IL-6, IL-8 and IFN-γ in pathogenesis of central nervous system neuropsychiatric systemic lupus erythematous[J]. International Journal of Clinical & Experimental Medicine, 2015,8(9):16658.