HLA-G基因修饰的胎盘间充质干细胞对CD4+T淋巴细胞增殖的影响

崔桂玉，白剑，苗兰英，林大勇

(1内蒙古民族大学医学院，内蒙古通辽028000；2辽宁中医药大学)

器官移植是目前治疗终末期器官衰竭最有效的手段。移植早期由T细胞介导的急性排斥反应是导致移植失败的主要原因[1,2]。间充质干细胞是成体干细胞的一种，具有自我更新和多向分化潜能，由于其具有低免疫原性、来源广泛和免疫抑制等特点，目前已经应用于临床预防移植物抗宿主病[3]。间充质干细胞对机体免疫功能的调节作用已明确，但效果不佳。有研究报道，通过转染细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)和IL-10等基因，可增加间充质干细胞的免疫抑制功能[4～6]。人类白细胞抗原G(HLA-G)属于非经典的人类白细胞抗原Ⅰ(HLAⅠ)类分子，在孕妇体内高表达，其主要功能是诱导母婴耐受，具有明确的免疫抑制作用[7]。2016年10月～2017年2月我们观察了HLA-G基因修饰的胎盘间充质干细胞对CD4+T淋巴细胞增殖的影响，现分析结果，探讨其预防移植物抗宿主病的可行性。

1 材料

RPMI 1640培养基、DMEM/DF12培养基(Gibco公司)，Percoll分离液(GE公司)，单克隆抗体CD45-Percp/CD34-PE/HLA-DR-FITC/CD29-PE/CD44-FITC/CD 105-APC、PEGFP-N1-HLA-G全基因合成质粒(北京奥科鼎盛生物科技有限公司)，LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)，HLA-G特异性单抗4H84和α-Tublin(Santa Cruz公司)；CD4+分选试剂盒(Miltenyi公司)，四氮唑蓝(MTT)、胶原酶Ⅳ(Sigma公司)。实验所用分析纯试剂均购于国药集团北京分公司。足月新生儿胎盘取自辽宁中医药大学附属医院，健康人血液取自健康体检者。本研究内容新生儿父母及健康体检者均知情同意，并经本院伦理委员会讨论通过。

2 方法及结果

2.1 胎盘间充质干细胞的分离、培养及鉴定 将新生儿胎盘表面用75%乙醇消毒，并用生理盐水反复冲洗3次，在超净工作台中用眼科剪刀剪成1～2 mm2碎块，放入50 mL离心管中，用生理盐水冲洗直至管中生理盐水澄清为止；1 500 r/min离心5 min后弃上清液，加入含0.25%胰酶和0.1%胶原酶Ⅳ的生理盐水30 mL，培养箱中孵育30 min；用100目滤网过滤胎盘碎块，收集过滤液体于15 mL离心管中，1 500 r/min离心5 min后弃生理盐水，在细胞沉淀中加入含10% FBS的DMEM/DF12培养基，充分混匀并转移至培养瓶中；待细胞贴壁后生长至融合度90%左右时用0.25%胰酶消化，接种于新的培养瓶中。当细胞进入对数生长期后，将其消化制备单细胞悬液并调整密度至1×106个/mL；取200 μL细胞悬液，分别加入CD45-Percp/CD34-PE/HLA-DR-FITC/CD29-PE/CD44-FITC/CD105-APC流式抗体各5 μL，避光室温孵育20 min；采用流式细胞仪检测细胞中CD34和血管内皮生长因子2(VEGRF-2)表达，Cell Quest软件进行结果分析[8]。结果显示，第2代胎盘间充质干细胞CD45、CD34和HLA-DR呈阴性表达，CD29、CD44和CD105呈阳性表达。提示胎盘间充质干细胞分离培养成功。

2.2 胎盘间充质干细胞转染HLA-G基因及鉴定 将对数生长期的胎盘间充质干细胞以2×105个/mL接种到6孔板，加入含10% FBS的DMEM/DF12培养基3 mL，待细胞融合度达80%时将细胞随机分为PEGFP-N1-HLA-G组、PEGFP-N1组、对照组，前两组分别采用LipofectamineTM2000试剂转染PEGFP-N1-HLA-G质粒及空载体PEGFP-N1，孵育4 h后弃转染液，加入含10% FBS的DMEM/DF12培养基3 mL，在培养箱内继续培养20 h；对照组常规培养20 h。采用Western blotting法检测三组HLA-G(1∶1 000)相对表达量。结果显示，PEGFP-N1-HLA-G组、PEGFP-N1组、对照组HLA-G蛋白相对表达量分别为1.01±0.03、0.39±0.03、0.37±0.04，PEGFP-N1-HLA-G组高于其他两组(P均<0.01)。提示转染PEGFP-N1-HLA-G质粒可促进HLA-G蛋白表达，转染成功。

2.3 健康人外周血CD4+T淋巴细胞分离 取健康人末梢血10 mL，加入等体积的Percoll分离液，放入50 mL离心管中1 500 r/min离心20 min，吸取液面交界处的有核细胞，并将细胞转移至15 mL离心管中，使用PBS稀释后1 500 r/min离心5 min，弃上清液，再加入10 mL PBS重复离心清洗一次，加入PBS稀释并调整有核细胞密度为1×107个/mL。取150 μL细胞悬液加入40 μL CD4 MicroBeads混匀并在培养箱中孵育10 min，将LS柱放置于MACS分选架上，用缓冲液冲洗，将孵育好的细胞悬液导入LS柱中，用3 mL缓冲液冲洗一次。CD4+T淋巴细胞滞留于LS柱中，用缓冲液将LS柱中吸附的CD4+T淋巴细胞冲洗下来，并用15 mL离心管离心备用。

2.4 胎盘间充质干细胞与CD4+T淋巴细胞混合培养及细胞增殖抑制率检测 计数2.2中转染或常规培养4 h的各组胎盘间充质干细胞，分别以1×104个/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后在每孔中按照CD4+T淋巴细胞和胎盘间充质干细胞以1∶10比例加入CD4+T淋巴细胞。同时设无干细胞的CD4+T淋巴细胞为空白对照组。将空白对照组、对照组、PEGFP-N1组和PEGFP-N1-HLA-G组细胞均放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养，分别于培养24、48和72 h时采用MTT法检测四组CD4+T淋巴细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(空白对照组-实验组)/空白对照组×100%。结果显示，PEGFP-N1-HLA-G组细胞培养24、48、72 h时CD4+T淋巴细胞的增殖抑制率均高于对照组和PEGFP-N1组(P均<0.05)，见表1。提示转染PEGFP-N1-HLA-G的胎盘间充质干细胞抑制CD4+T淋巴细胞增殖。

3 讨论

表1 各组培养24、48、72 h时的细胞增殖抑制率比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与PEGFP-N1组比较，#P<0.05。

胎盘间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，免疫原性低，具有免疫抑制功能，目前在医疗领域主要用于治疗缺血性疾病、糖尿病、心血管疾病、肿瘤、移植排斥和自身免疫性疾病等[9]。胎盘间充质干细胞免疫抑制功能涉及免疫应答的多个环节，包括改变抗原递呈细胞成熟、抑制树突状细胞活化和诱导调节性T细胞产生等[10,11]。有研究报道，间充质干细胞能够抑制细胞增殖，可能与其负向免疫调节作用有关[12]。HLA-G是一种非经典MHC-Ⅰ类抗原，其受体主要有ILT2、ILT4和KIR2DL4三种[13]。其中ILT4主要分布在单核细胞和树突状细胞等髓样细胞表面，HLA-G、ILT4相互作用可促进树突状细胞分泌IL10，进而抑制T淋巴细胞功能，同时活化的树突状细胞可以诱导T淋巴细胞分化为CD4+CD25+FoxP3+Treg，还可诱导T淋巴细胞分化成具有免疫抑制功能的CD3+CD4low或CD3+CD8low的Treg细胞，不表达FoxP3转录因子，最终导致机体发生免疫耐受[14,15]。

CD4+T细胞各亚群均在细胞免疫反应中发挥重要作用，能促进B细胞、T细胞和其他免疫细胞增殖与分化，协调免疫细胞间的相互作用。根据CD4+T细胞活化后分泌产生细胞因子谱不同，可将CD4+T细胞分为Th1、Th2、Th9、Th17和Thf等多种不同亚型，各亚型共同参与机体免疫调节。但目前CD4+T细胞在器官移植排斥反应中的具体作用尚未形成共识。多数研究者认为CD4+CD25+FoxP3+Treg、Th17和Thf可诱导移植器官在体内形成免疫耐受，有利于延长移植物在受者体内的存活时间。胎盘间充质干细胞对于诱导体内产生CD4+T淋巴细胞有着明确的作用，但诱导能力较弱，原因主要为受者体内免疫系统对外来细胞的免疫清除和胎盘间充质干细胞自身的免疫抑制功能。

本研究首先在体外合成HLA-G基因质粒，并通过脂质体转染的方式修饰胎盘间充质干细胞，使其获得较强的免疫抑制功能。胎盘间充质干细胞与CD4+T淋巴细胞混合培养24、48、72 h时，PEGFP-N1-HLA-G组胎盘间充质干细胞对CD4+T淋巴细胞的增殖抑制率均高于对照组和PEGFP-N1组，且混合培养48 h时对T淋巴细胞增殖的抑制效果最佳。胎盘间充质干细胞本身可以表达HLA-G蛋白，但对CD4+T淋巴细胞的增殖抑制作用较弱；经过HLA-G基因修饰后的胎盘间充质干细胞抑制CD4+T淋巴细胞增殖的作用显著增加，提示HLA-G蛋白参与了T淋巴细胞的增殖过程；经过HLA-G基因修饰后的HLA-G蛋白可对受者体内的免疫细胞产生直接抑制作用，减少胎盘间充质干细胞被体内现有免疫细胞清除的比例，增加免疫抑制作用，可能用于预防移植物抗宿主病。

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