长链非编码RNA H19对胃癌细胞侵袭、迁移的影响及其机制

吴小飞，康海锋，陈赛赛，赵程进

(1 南通市第一人民医院，江苏南通226001；2 南通大学附属医院)

人类基因组计划表明，哺乳动物基因组中，仅有1.2%基因能够编码蛋白质，且大多数基因转录产物为非编码RNA[1～3]，长链非编码RNA(lncRNAs)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA[4]，已证实其在肿瘤形成和侵袭过程中发挥作用。最近的研究证实lncRNA H19在乳腺癌[5]和宫颈癌[6]等多种肿瘤组织中表达增加。H19表达与肿瘤分级密切相关，且可以作为膀胱癌复发早期的诊断靶分子[7]；H19异常表达能够促进肝癌细胞的体外肿瘤形成能力[8]。以上研究结果均提示H19可能具有促癌基因的功能，但其与胃癌的关系尚不明确。2017年2～8月，本研究观察了上调、下调胃癌细胞H19表达对胃癌细胞侵袭、迁移能力的影响，现分析结果并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌细胞株MKN28、BGC-823(中国科学院上海细胞库)；RPMI 1640培养基和FBS(美国Gibco公司)；TRIzol试剂和脂质体Lipofectamine®3000(美国Invitrogen公司)，RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒(北京宝日医生物技术有限公司)，实时荧光定量 PCR引物、全长H19 cDNA、突变H19 cDNA(不含第一个内含子)、H19 siRNA 和siRNA无关序列(上海吉玛制药技术有限公司)，Matrigel基质胶(美国BD公司)，结晶紫溶液(百灵威科技有限公司)，EZ-Magna RIP Kit试剂盒(美国Millpore公司)，RIPA蛋白裂解液和BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，COL4A1(ab21295)、CPT1C(ab87498)、ISM1(ab103338)、THBS4(ab121094)和GAPDH(ab9485)抗体(美国Abcam公司)，HRP标记的鼠抗兔二抗(上海恒远生物科技有限公司)。二氧化碳培养箱(240i/150i，美国Thermo公司)，NanoDrop分光光度计(ND-2000，美国Thermo公司)，定量PCR扩增仪(ABI7500，美国ABI公司)，Transwell小室(美国Corning公司)，酶标仪(ELx800，美国Bio-Tek公司)，凝胶成像仪(GelDoc XR，美国Bio-Rad)。

1.2 细胞分组及转染 将MKN28、BGC-823细胞分别置于含RPMI 1640培养基(含10% FBS)的培养箱中，37 ℃、5% CO2条件下培养，取复苏后第4～10代细胞进行试验。①上调H19表达：取对数生长期MKN28细胞，接种于培养皿中，24 h后将细胞分为MKN28/H19组、MKN28/H19mut组和空白对照1组，每组5孔，每孔约1×105个。空白对照组不转染；MKN28/H19组、MKN28/H19mut组采用脂质体法分别转染全长H19 cDNA和突变H19 cDNA(不含第一个内含子)；按步骤参照试剂盒说明书操作。转染12 h。②下调H19表达：取对数生长期BGC-823细胞，接种于培养皿中，24 h后将细胞分为BGC-823/siH19组、BGC-823/NC组和空白对照2组，每组5孔，每孔约1×105个。空白对照组不转染。BGC-823/siH19组、BGC-823/NC组采用脂质体法将分别转染H19 siRNA(5′-CATCAAAGACACCATCGGA-3′)及H19 siRNA无关序列，试剂盒说明书操作。转染12 h。

1.3 相关指标观察

1.3.1 H19表达 TRIzol法提取上述组织样本和细胞中总RNA，提取步骤参照RNA提取试剂盒的说明书。NanoDrop分光光度计检测总RNA浓度及纯度(OD260/OD280比值)，逆转录试剂盒逆转录获得cDNA，置于-20 ℃保存备用。采用实时荧光定量PCR法检测各组H19相对表达量。H19正向引物5′-GTCCGGCCTTCCTGAACACCTT-3′，H19反向引物5′-GCTTCACCTTCCAGAGCCGAT-3′；内参β-actin正向引物 5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCGCTC-3′，β-actin反向引物 5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3′。反应体系为10 μL，反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共进行35个循环。采用2-ΔΔCt法计算H19相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3.2 细胞侵袭能力 采用Transwell细胞侵袭试验。Transwell小室放置于24孔板中，加入50 μL Matrigel基质胶(250 μg/mL)，37 ℃、5% CO2培养箱中过夜，对上室的聚碳酯膜进行包被。在Transwell小室的下室中加入500 μL含10% FBS的RPMI 1640。用无血清的RPMI 1640培养液重悬各组细胞，取100 μL细胞悬液(细胞总数约1×105个)转移至Transwell小室的上室。24 h后去除下室中的培养液，Transwell小室置于甲醛中固定5 min，棉签擦去Transwell小室内室膜上的细胞，结晶紫溶液(0.1%)染色5 min，双蒸水漂洗后，显微镜下观察，每孔随机选取3个视野拍照。每个Transwell小室的上室中加入100 μL RIPA细胞裂解液，收集裂解液后，酶标仪检测570 nm处的吸光度(OD570)值并记录，以其表示各组细胞的侵袭能力。实验重复3次，取平均值。

1.3.3 细胞迁移能力 采用Transwell细胞迁移试验。除不加基质胶外，其余同1.3.2，以OD570值表示各组细胞迁移能力。

1.3.4 H19共结合蛋白CPT1C表达 检索Gene Ontology (GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 数据库，构建H19共表达网络，Bonferroni多重校正后筛选出可能与H19共表达的候选蛋白有COL4A1、CPT1C、ISM1和THBS4。在BGC-823细胞中采用RIP-PCR法进行验证结果显示CPT1C蛋白是H19的共结合蛋白。采用Western blotting法检测各组CPT1C蛋白。收集各组约1×107个细胞，加入RIPA蛋白裂解液，提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。8% SDS-PAGE分离蛋白后，湿转法将蛋白转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温震荡封闭1 h，TBS-T洗膜，分别加入CPT1C和内参GAPDH抗体，4 ℃孵育过夜。TBS-T洗膜后，加入HRP标记的鼠抗兔二抗，室温孵育1 h，加ECL发光液进行化学发光显影，凝胶成像仪对蛋白条带进行观察，获取图像，采用Image Lab软件对图像进行灰度分析，记录灰度值，用CPT1C蛋白与内参蛋白灰度值的比值表示CPT1C相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 上调H19表达对胃癌MKN28细胞侵袭、迁移能力及CPT1C蛋白表达的影响 转染12 h时MKN28/H19组、MKN28/H19mut组、空白对照1组H19相对表达量、侵袭能力、T迁移能力、CPT1C相对表达量见表1。转染12 h时MKN28/H19组H19相对表达量、侵袭能力、迁移能力、CPT1C相对表达量均高于MKN28/H19mut组、空白对照1组(P均<0.05)，MKN28/H19mut组上述指标与空白对照1组相比，P均>0.05。

表1 转染12 h三组MKN28细胞H19相对表达量、侵袭能力、迁移能力、CPT1C相对表达量比较

注：与MKN28/H19mut组、空白对照1组比较，*P<0.05。

2.2 下调H19表达对胃癌BGC-823细胞侵袭、迁移能力及CPT1C蛋白表达的影响 转染12 h时BGC-823/siH19组、BGC-823/NC组、空白对照2组BGC-823细胞H19相对表达量、侵袭能力、迁移能力、CPT1C相对表达量见表2。转染12 h时BGC-823/siH19组H19相对表达量、侵袭能力、迁移能力、CPT1C相对表达量均低于BGC-823/NC组、空白对照2组(P均<0.05)，BGC-823/NC组上述指标与空白对照2组相比，P均>0.05。

表2 转染12 h三组BGC-823细胞H19相对表达量、侵袭能力、迁移能力、CPT1C相对表达量比较

注：与BGC-823/NC组、空白对照2组比较，*P<0.05。

3 讨论

目前关于胃癌细胞发生侵袭和迁移的内在作用机制尚不明确，临床亦缺乏转移性胃癌的有效干预手段。本研究的主要目的是寻找与胃癌侵袭和迁移相关的lncRNAs。

lncRNAs可通过多种机制调控基因表达。大量研究证据表明，lncRNAs异常表达是导致肿瘤发生、发展的一个重要因素，如lncRNAs可通过调节促癌基因或者抑癌基因信号通路，参与肿瘤形成、恶性进展和侵袭过程[9～12]。H19在肝癌[8]、头颈部扁平细胞癌[13]等多种肿瘤组织中表达升高，且其高表达常常与肿瘤患者的不良预后相关。H19在多种胃肠道肿瘤形成和恶性进展中发挥作用，如在结直肠癌中，lncRNA H19可促进细胞上皮间质转化(EMT)过程[14]；在食管癌中，H19表达增加可促进细胞侵袭，并诱导EMT[15]。Chen等[16]认为，lncRNA H19可作为胃癌诊断的分子标志物，其高表达提示患者预后不良。本研究结果显示，采用脂质体转染技术上调H19表达可提高胃癌细胞的侵袭和迁移能力，而抑制H19表达可抑制胃癌细胞的侵袭和迁移能力。提示H19与胃癌细胞发生侵袭和迁移有关。其原因是H19可调节HMGA1基因[17]、EZH2基因[18]等侵袭、迁移相关基因表达。也有研究表明，H19可促进胃癌细胞增殖[19,20]，本研究并未对此结论进行验证。

lncRNAs调节基因转录的机制非常复杂。本研究对 H19促进胃癌细胞侵袭和迁移的内在机制进行了初步探究。H19可通过与特定蛋白或者microRNAs相互作用，直接或者间接调节靶基因表达[21]。本研究中生物信息学分析结合RIP-PCR验证结果表明CPT1C可能是H19共表达蛋白，进一步采用Western blotting法检测各组细胞CPT1C表达，发现改变H19表达后，细胞中CPT1C蛋白表达也随之改变，其趋势与H19变化一致，进一步证实上述结论。CPT1C是脂肪酸氧化代谢限速酶CPT1家族的重要成员，在脂肪酸代谢和糖分解中的发挥着重要作用。目前，关于CPT1C在肿瘤中的研究甚少，有研究发现CPT1C高表达可能与肿瘤细胞化疗耐药有关，而在乳头状甲状腺癌中AMPK可调节CPT1C基因表达，从而促进肿瘤细胞存活[22]。

综上所述，H19能增强胃癌细胞的侵袭和迁移能力，其机制可能为调节CPT1C蛋白表达。今后的研究中我们将对H19/CPT1C在胃癌细胞侵袭和迁移过程中的具体调节机制进行探讨。

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