黑果枸杞对大鼠抗焦虑作用的研究及对海马内单胺类神经递质的影响

马晓杰，陈轶，刘洁，蔺明煊，郭建友，石晋丽*

(1.北京中医药大学中药学院，北京 102488；2.中国科学院心理研究所心理健康重点实验室，北京 100101)

黑果枸杞(LyciumrutheniumMurray.)属茄科枸杞属植物，以干燥成熟果实入药，在《晶珠本草》《四部医典》等藏医药学经典著作中均有记载，现多为西藏、青海和新疆民间药用或食用。《晶珠本草》[1]中认为其性平、味甘，功效清心热，主治心脏病和妇科病。

国内外研究表明，黑果枸杞的药效成分主要为花色苷类天然色素，且含量远高于常见的花色苷来源植物如紫薯、蓝莓以及葡萄等[2-5]。花色苷类天然色素具有出色的抗氧化和清除自由基能力[5-8]，以及抗炎、抗癌、预防心血管疾病、预防神经退行性疾病和改善认知、提高记忆力等作用[9-12]。其中对神经细胞的保护作用、预防治疗脑部神经官能症的研究正逐渐成为热点。单胺氧化酶(MAO)活性的升高一直与抑郁、焦虑和神经退行性疾病有关，Dreiseite等通过研究花青素，原花青素和酚类代谢产物对MAO的抑制作用，推测了花青素及花色苷的新兴神经保护作用，表明其具有治疗抑郁症、焦虑症和退行性疾病的潜力[13]。黑果枸杞富含花色苷类成分，具有治疗焦虑症、抑郁症及其他一系列脑部神经症的潜力。因此，本文主要探讨黑果枸杞的抗焦虑作用及其与海马组织单胺类神经递质的关系。

1 材料

1.1 药材与样品制备

黑果枸杞果实采自青海省都兰县，果期2015年6月；黑果枸杞提取物实验室自制。150 g黑果枸杞干燥果实粉碎后用1.5 L石油醚过夜浸泡脱脂，3.75 L 80%乙醇(含2%甲酸)50℃水浴避光浸提2次，每次3 h。50℃真空旋蒸除去乙醇，过AB-8大孔树脂，80%乙醇(含2%甲酸)洗脱，50℃真空旋蒸除去乙醇，冷冻干燥得12.062 5 g年取物，得率为8.04%。pH示差法测提取物中花色苷含量，以锦葵素-3-O葡萄糖苷计为(5.76±0.06) mg/100 mg。折合生药中含量为(463.13±4.86) mg/100 g(dw)。

1.2 动物

SD雄性大鼠，SPF级，体质量(160±10)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK(京)(2015-0012)。

1.3 试剂与仪器

地西泮(DZP，北京益民药业有限公司，批准文号：国药准字H11020898)；氯化钠注射液(石家庄四药有限公司，批准文号：国药准字H13023200)；羧甲基纤维素钠(天津市福晨化学试剂厂，批号20110805)；5-HT、DA(美国SIGMA公司)；甲醇(色谱级，美国Fisher Scientific公司)；二正丁胺(BAS进口分装);乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、乙酸钠(分析纯，上海化学试剂厂)；高氯酸、B8离子对试剂(天津化学试剂二厂)。

高架十字迷宫(AES-M02型，AVTAS 3.0软件)；旷场设备；Alliance 2695高效液相色谱仪(ECD 2465检测器)；超声细胞粉碎机(JY88-ⅡN，宁波新芝生物科技有限公司)；高速冷冻离心机(SORVALL Stratos,Thermo science)；数控超声波清洗器(KQ-250DE型，昆山禾创超声仪器有限公司)；电子分析天平(MA240D型, 上海博通医用仪器厂)；精密pH计(PHS-3B，上海光学仪器厂)。

2 方法

2.1 动物分组与处理

大鼠单笼饲养，随机分组：空白组、阳性药物组(DZP组)、黑果枸杞提取物低剂量组、中剂量组、高剂量组。其中药物低、中、高剂量组分别按0.6 g/(kg·d)、1.2 g/(kg·d)和2.4 g/(kg·d)给予灌胃，DZP组给予1.0 mg/(kg·d)灌胃，空白组灌服等容积的生理盐水，连续7 d灌胃给药。于第7 d，中药组、空白组末次给药1 h后，DZP组灌胃0.5 h后，进行旷场实验和高架十字迷宫实验测试，测试完毕，立即取材。

2.2 大鼠行为学实验

2.2.1 旷场实验(OFT)

半径90 cm，高60 cm的圆形旷场(半径45 cm的圆形区域内称为中央区)，每只大鼠在测试前，任其在动物盒中自由活动5 min，然后迅速转移至旷场开场边缘区，由视频跟踪系统自动记录5 min内大鼠的活动情况。记录指标为大鼠进入中央区的次数及停留的时间。

2.2.2 高架十字迷宫实验(EPM)

实验室室温20 ℃左右，保持安静，以动物灯照明。每只大鼠在测试前，任其在动物盒中自由活动5 min，然后迅速转移至高架十字迷宫的中央平台处，由视频跟踪系统自动记录5 min内大鼠进入开臂的次数(Open arm entry, OE)和停留时间(Open arm time，OT)，进入闭臂的次数(Close arm entry, CE)和停留时间(Close arm time, CT)。焦虑行为指标为大鼠进入开臂次数与入臂总次数百分比(OE%)、在开臂内停留时间与入臂总时间百分比(OT%)。每只大鼠测试结束以75%酒精擦拭高架，清除粪便，再进行下一只大鼠的测试。

2.3 大鼠海马单胺类神经递质及其代谢产物含量测定

2.3.1 蛋白沉淀剂的配置

配置含0.5 mmol亚硫酸钠、0.3 mmol乙二胺四乙酸二钠，浓度为0.1 mol/L高氯酸溶液。

2.3.2 标准品溶液的配置

分别精密称量五羟色胺(5-HT)、五羟吲哚乙酸(5-HIAA)、多巴胺(DA)、二羟苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)标准品适量，加0.1 mol/L高氯酸溶液配成100 μg/mL的标准品储备液，-30℃条件下保存，临用前再定量混合，配置成浓度为102 ppm DOPAC，98 ppm DA，101 ppm 5-HIAA，89 ppm HVA，101 ppm 5-HT混合溶液，并以体积为0.5 μL、1 μL、2 μL、4 μL、8 μL、12 μL进样。

2.3.3 样品处理

大鼠行为学实验结束后立即断头并迅速在冰盘上剥离海马组织，用冰冷的生理盐水洗净，滤纸拭干，-80℃保存。分析时称重后放入玻璃匀浆器中，加入预冷的蛋白沉淀剂匀浆，离心(12 000 r/min，10 min，4 ℃)2次，取上清液，0.45 μm微孔滤膜过滤，采用HPLC-ECD分析。

2.3.4 色谱条件

色谱柱：Atlantis C18柱(2.1mm×150 mm,3 μm)，流动相：A为50 mM柠檬酸-乙酸钠(pH值3.5，内含1.8 mM二正丁胺、1 mM B8离子对试剂、0.3 mM乙二胺四乙酸二钠)，流动相B为甲醇。96%A-4%B等度洗脱；流速为0.35 mL/min，进样量10 μl,检测电压为+ 0.75 V,结果以湿组织浓度计(μg/g)。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 LRE对大鼠旷场实验影响

与空白组相比，黑果枸杞提取物中剂量组可增加大鼠进入中央区的次数(P<0.05)，具有显著性差异，地西泮组、黑果枸杞提取物高剂量组大鼠进入中央区的次数显著增加(P<0.01)；上述3组大鼠在旷场中央区停留时间均增加(P<0.05)，具有显著性差异；与空白组相比，地西泮组、中药组对大鼠运动总路程无显著差异，说明地西泮和黑果枸杞提取物对大鼠自主活动无影响。具体见表1，图1。

表1 LRE对大鼠OFT的影响

注：与空白组相比，*P<0.05,**P<0.01

3.2 LRE对大鼠高架十字迷宫实验的影响

与空白组相比，地西泮组、黑果枸杞提取物中、高剂量组可增加大鼠进入开臂的次数百分比和在开臂活动时间百分比，具有显著性差异(P<0.05)，其中地西泮组可显著增加大鼠再开臂活动时间百分比(P<0.01)，具体见表2，图2。

表2 LRE对大鼠EPM的影响

注：与空白组相比，*P<0.05,**P<0.01

图2 LRE对大鼠EPM的影响

3.3 LRE对大鼠海马单胺类递质及其代谢产物的影响

与空白组相比，地西泮组、黑果枸杞提取物高剂量组大鼠海马5-HT及其代谢产物5-HIAA含量降低，具有显著性差异(P<0.05);而黑果枸杞提取物组大鼠海马DA及其代谢产物HVA、DOPAC含量无显著变化，具体见表3。表明LRE抗焦虑作用机制可能与其对焦虑后的5-HT能系统的调节作用有关。

表3 LRE对EPM大鼠海马单胺类神经递质及其代谢产物的影响

注：与空白组比较，**P<0.01，*P<0.05

4 讨论

旷场实验是由Hall等于1934年发明，其原理是利用大鼠因畏惧空旷场地的天性而产生驱避性活动[14]。通常以大鼠进入中央区的次数和停留时间为评价焦虑症的行为学指标。因其设备简单、操作便捷，被作为评价动物的运动行为学实验广泛使用。本实验中黑果枸杞提取物中、高剂量组可显著增加大鼠进入旷场中央区的次数，增加其停留时间，表现出明显的抗焦虑作用，且不影响大鼠的自主活动。高架十字迷宫具有简便快速敏感性好等优点，为抗焦虑研究中国际公认的应用最广泛的经典焦虑行为学实验[15-16]，因动物对高架新异环境有探究特性的同时又对其高悬敞开臂有恐惧心理，会形成心理上的矛盾冲突，从而可以考察其焦虑状态，动物进入开放臂次数比和开放臂停留时间比是该测试中的经典指标[17]。本实验中观察到黑果枸杞提取物的中、高剂量组大鼠进入开臂的次数百分比和在开臂活动时间百分比均提高，有明显的抗焦虑作用。

5-HT、DA均是与焦虑相关的主要单胺类神经递质,在海马、大脑皮质等边缘结构中含量的异常升高均会引发焦虑情绪[18-20]。高架十字迷宫实验证实不同种属大鼠的海马中5-HT含量与其焦虑程度呈正相关[21]。而研究表明，具有降低5-HT功能作用的药物能起到抗焦虑作用[22]，如经典抗焦虑药物地西泮[23-24]。多巴胺系统参与调节焦虑[25]，在功能上，该系统主要与情绪及本能活动有关[26]。本实验观察到，地西泮、黑果枸杞提取物中、高剂量组均能显著降低大鼠海马中5-HT的含量；地西泮使大鼠海马中DA及其代谢产物含量降低，而黑果枸杞提取物中、高剂量组对大鼠海马中DA含量仅显示出不同程度的降低作用趋势，提示地西泮和黑果枸杞提取物抗焦虑作用主要与其对海马中5-HT含量的调节作用有关，同时，从二者对5-HT的代谢产物5-HIAA含量亦有显著降低作用来看，推测地西泮和黑果枸杞提取物可能是通过抑制海马中5-HT合成与释放起抗焦虑作用。提示黑果枸杞提取物与阳性药物地西泮对大鼠海马中单胺类神经递质的调节作用可能有所不同。

自然界植物中较为常见的花色苷为矢车菊素衍生物，黑果枸杞花色苷中不含此类成分，主要是锦葵素、矮牵牛素、飞燕草素等的衍生物[2,27-29]，因此，关于黑果枸杞花色苷与其他花色苷类成分抗焦虑作用的比较及其抗焦虑作用的构效关系值得进一步探索。

综上所述，本研究首次探索了黑果枸杞对焦虑的作用，结果表明LRE在大鼠OFT和EPM实验中具有明确的抗焦虑作用，可能与调节5-HT能系统有关。这一研究结果为发掘传统藏药黑果枸杞的潜在药用价值，研发安全、有效的天然抗焦虑药物开辟了新的思路，对珍贵民族药资源的合理开发利用深有裨益。

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