基于小鼠焦虑模型研究黄连阿胶汤中鸡子黄的配伍作用

汪坤

【摘 要】 目的：研究黄连阿胶汤配伍鸡子黄的意义。方法：采用高架十字迷宫、明暗箱穿箱实验，测定小鼠脑内γ-氨基丁酸（GABA）和5-羟色胺（5-HT）的含量；测定小鼠血清中去甲肾上腺素（NE）的含量，研究黄连阿胶汤配伍鸡子黄对处方抗焦虑作用的影响。结果：与模型组相比，黄连阿胶汤配伍鸡子黄后4.0 g/kg、2.0 g/kg能显著增加小鼠进入高架十字迷宫OT%（P<0.05），8.0 g/kg能显著降低小鼠脑内5-HT的含量（P<0.05），8.0 g/kg、4.0 g/kg 能显著降低小鼠血清内NE的含量（P<0.05）。结论：黄连阿胶汤中配伍鸡子黄可以增强抗焦虑作用。

【关键词】 黄连阿胶汤；鸡子黄；抗焦虑

【中图分类号】R 285.6 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）10-0018-04

Abstract：Objective To study the therapeutic influence of compatibility of egg yolk in Huanglian ejiao decoction. Methods Elevated plus-maze test and light-dark transition test were used. The contents of Gammer Amino Butyric Acid（GABA），5-serotonin （5-HT） in the mouse brain and the content of norepinephrine （NE） in mouse serum were determined. The therapeutic effect of anti-anxiety of compatibility of egg yolk in Huanglianejiao decoction was researched. Results Compared with the model groups， the compatibility of egg yolk in Huanglianejiao decoction 4.0 g/kg，2.0 g/kg could significantly increase the mice into the overhead cross maze OT （P<0.05），8.0g/kg significantly reduce the content of 5-serotonin （5-HT） in mouse brain（P<0.05），8.0 g/kg，4.0 g/kg significantly reduce the content of norepinephrine （NE） in mouse serum（P<0.05）.Conclusion The compatibility of egg yolk in Huanglianejiao decoction couldpromote the anti-anxiety effect.

Keywords：Huanglianejiao Decoction； Egg Yolk； Anti-anxiety

黄连阿胶汤出自张仲景所著《伤寒论》[1]第303条：“少阴病，得之二三日以上，心中烦，不得卧，黄连阿胶汤主之”。处方中以黄芩、黄连清心火，以阿胶、白芍、鸡子黄滋肾水，使水火既济，心肾相交，诸证得愈。但鸡子黄一药，历代医家注解颇多。《注解伤寒论》[2]曰：“阴不足，以甘补之，鸡子黄之甘以补血”；《伤寒附翼》[3]曰：“鸡子黄禀南方之火色，入通于心，可以补离宫之火，用生者搅和，取其流动之义也”；《伤寒溯源集》[4]曰：“鸡子苦，气味俱厚，阴中之阴，故能补阴除热”；《绛雪园古方选注》[5]曰：“鸡子黄色赤，入通于心，补离中之气”。历代医家或主要根据法象药理学理论对鸡子黄的作用进行注解，对其配伍作用较为推崇。然而亦有现代研究认为处方中不用鸡子黄者[6]。另根据《伤寒论》中鸡子黄用量为两枚，待药液“小冷，纳鸡子黄，搅令相得”。最后所得到的黄连阿胶汤黄褐色，较粘稠，有较重腥味，难以入口。其中鸡子黄是引起黄连阿胶汤煎剂色泽和味道较差的重要因素。现代药理研究，黄连阿胶汤具有明显的抗焦虑作用[6]。为了让患者能够顺利服药，并考虑到鸡子黄在处方中为佐药。本实验基于黄连阿胶汤的抗焦虑作用研究鸡子黄配伍的必要性。

1 材料与方法

1.1 材料 鸡子黄为鸡蛋（购于思达超市）去除蛋清后的鸡子黄；地西泮（规格2.5 mg/片，批号20090521，广东三才医药集团有限公司），GABA试剂盒（R&D;公司），5-HT试剂盒（R&D;公司），NE试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 动物 SPF级昆明种小鼠，体重（20±2）g，均为雄性，购自郑州大學医学院实验动物中心。小鼠生产许可证号：SCXK（豫）2010-0002。

1.3 仪器 高架十字迷宫装置（批号20050228，成都泰盟科技有限公司）；小鼠明暗箱（自制，实验装置包括相连的明暗两个小室组成。整个装置为1个44 cm×21 cm×21 cm的动物笼，笼子的2/3部分为明室（由旁边所放的台灯照亮）；1/3为暗室，由隔板将明暗两室分开，隔板规格为21 cm×21 cm；小鼠可在明暗两室之间自由活动）；Enspire 2300 多功能酶标仪（美国 PerkinElmer 公司）；电动匀浆器（IKA，德国）。

1.4 实验样品的制备

1.4.1 阳性药的制备 取地西泮两片研钵中研细，加蒸馏水25 mL，得0.2 mg/mL地西泮药液。

1.4.2 黄连阿胶汤全方高剂量组及缺鸡子黄黄连阿胶汤高剂量组的制备 取黄连48 g，黄芩24 g，白芍24 g，煎煮2次，第1次加水1 200 mL，浸泡30 min后煎煮30 min，第2次加水800 mL，煎煮20 min，合并水煎液浓缩至200 mL，去滓趁热加阿胶36 g炀化，搅均后等分，一份为缺鸡子黄黄连阿胶汤高剂量组（0.66 g/mL）；一份待稍冷（50℃以下）后加入两枚鸡子黄，即黄连阿胶汤高剂量组。

1.4.3 黄连阿胶汤中、低剂量 取高剂量黄连阿胶汤，用蒸馏水配成0.40 g/mL、0.20 g/mL溶液。

1.4.4 缺鸡子黄黄连阿胶汤高剂量中、低剂量 取缺鸡子黄黄连阿胶汤高剂量，配成0.33 g/mL、0.165 g/mL溶液。

1.5 实验方法

1.5.1 分组与给药 雄性小鼠100只，18～22 g，随机分成8组，正常组、阳性组、黄连阿胶汤全方高、中、低剂量组，缺鸡子黄黄连阿胶汤方高、中、低剂量组。室温保持在20 ℃左右，保持安静，不限食水饲养3d，接着连续灌胃5d，每组依次给予生理盐水，2.0 mg/Kg地西泮混悬液，黄连阿胶汤全方提取液高、中、低剂量，缺鸡子黄黄连阿胶汤提取液高、中、低剂量，灌胃为体积0.2 mL/10 g。5 d后进行十字迷宫和明暗箱穿箱的行为学实验。

1.5.2 行为学实验[7]

1.5.2.1 十字迷宫实验 于末次给药30 min后将小鼠放在塑料箱中（60 cm×40 cm×40 cm）活动，任其自由探究5min后然后迅速至于EPM的中央平台处，使头朝开放臂，放下小鼠的同时另一人员用鼠标点击“开始实验”。预先在电脑上设置好十字迷宫跟踪系统，电脑自动记录行踪。每只小鼠5 min，中间用湿布擦拭迷宫，清除粪便。以小鼠开放臂进入次数百分比（OE%）即开放臂进入次数/（开放臂进入次数+封闭臂进入次数）和开放臂滞留时间百分比（OT%）即开放臂滞留时间/（开放臂滞留时间+封闭臂滞留时间）作为评价药物抗焦虑作用的指标。

1.5.2.2 明暗箱穿箱实验 十字迷宫实验结束后马上进行明暗箱测试。测试前10 min将小鼠放在宽阔的塑料箱中进行适应性活动10 min，然后由一名测试人员把小鼠（背对暗箱）放入明箱中，同时打开秒表，盖上明箱盖子，记录10 min内小鼠穿箱次数。

1.5.3 生化指标检测

1.5.3.1 小鼠脑组织中GABA和5-HT的含量测定 小鼠行为学观察后，立即断头处死，冰台上迅速剥离全脑，然后用分析天平称量其重量，根据此重量计算应加入的冰冷的生理盐水的量，以脑组织（g）∶[KG-*3/5]生理盐水（mL）=1∶[KG-*3/5]9的比例在低温下用玻璃匀浆机进行匀浆，4℃下3 000 r/min离心20 min，取上清液于-20℃以下低温保存。制成10%的脑匀浆按测试盒说明操作，分别测定脑组织中GABA和5-HT的含量。

1.5.3.2 小鼠血清中NE水平测定 行为学实验结束后立即摘眼球取血1 mL，室内静置2 h，4 000 r/min离心10 min，取血清置于1.5 mLEP管内，80℃储存。ELISA试剂盒法测定血清中NE水平。

1.5.4 统计学方法 数据分析用SPSS13.0 for windows统计软件包进行数据资料的统计学处理，各组间比较采用单因素方差分析，计量资料用平均数加减标准差表示，组间比较用方差分析（LSD法），等级资料采用Riddit检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

[JP+1]

2.1 高架十字迷宫、明暗箱实验结果 与正常组比较，阳性药物地西泮能显著增加小鼠进入高架十字迷宫OE%（P<0.05） OT%（P<0.05）和小鼠明暗箱穿箱次数（P<0.05）；黄连阿胶汤全方4.0 g/kg、2.0g/kg能显著增加小鼠进入高架十字迷宫OE%（P<0.05）和OT%（P<0.05）；黄连阿胶汤全方4.0 g/kg、能显著增加小鼠明暗箱穿箱次数（P<0.05）；黄连阿胶汤缺鸡子黄组对小鼠进入高架十字迷宫OE%（P<0.05）、OT%（P<0.05）无显著性影响，8.0 g/kg能显著增加小鼠明暗箱穿箱次数（P<0.05）。见表1、表2。

2.2 生化指标检测结果

2.2.1 小鼠脑组织中GABA和5-HT的含量测定 与正常组比较，阳性药物地西泮能显著提高小鼠脑内GABA含量（P<0.05），降低脑内5-HT的含量；黄连阿胶汤配伍鸡子黄8.0g/kg、4.0g/kg能显著增加小鼠脑内GABA含量，8.0g/kg能显著降低5-HT的含量；黄连阿胶汤缺鸡子黄方对小鼠脑内5-HT的含量无显著性影响，8.0g/kg能显著增加小鼠脑内GABA含量。见表3。

2.2.2 小鼠血清中NE水平测定 与正常组比较，阳性药物地西泮能显著降低小鼠血清中NE含量（P<0.01）；黄连阿胶汤全方8.0g/kg、4.0g/kg降低小鼠血清中NE含量；黄连阿胶汤缺鸡子黄方对焦虑小鼠血清中NE含量无显著性影响。见表4。

3 討论

高架十字迷宫和明暗箱实验两种模型均是利用新异环境及光线造成焦虑刺激的行为，由于这些模型引起的动物焦虑状态方法较为快速简便。赵玉堂使用高架十字迷宫焦虑小鼠模型发现黄连阿胶汤具有明显的抗焦虑作用[6]，故本实验选用此经典模型进行鸡子黄抗焦虑作用研究。

实验动物在受到新异环境及光线刺激造成焦虑刺激之后，丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴系统被激活，如NE的含量上升；脑组织神经递质释放量改变[8-9]。GABA为大脑内的抑制性氨基酸，5-HT为大脑内的兴奋性氨基酸[10]，黄连阿胶汤全方高剂量组与缺鸡子黄高剂量组相比能够显著降低焦虑模型小鼠脑内的5-HT含量，降低焦虑模型小鼠脑内的NE含量；说明黄连阿胶汤配伍鸡子黄可能通过降低焦虑模型小鼠脑内兴奋性氨基酸和降低丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴系统释放发挥抗焦虑作用。不论是高架十字迷宫和还是明暗箱实验，黄连阿胶汤配伍鸡子黄灌胃的小鼠对新异环境及光线造成的焦虑刺激的抵抗都优于缺鸡子黄黄连阿胶汤灌胃的小鼠；对不同组内小鼠体内生化指标的进行检测，全方黄连阿胶汤灌胃的小鼠体内兴奋性氨基酸含量较低，而抑制性氨基酸含量较高，以上实验均表明黄连阿胶汤配伍鸡子黄抗焦虑作用较优，因此原方配伍鸡子黄是有必要的。

黄连阿胶汤中黄连和黄芩两味药合煎后黄连中的异喹啉型生物碱与黄芩中多酚类成分生成了分子量较大的水不溶性化合物[11]。文献报道[12]黄连、黄芩共同煎煮时有效成分虽然相互结合生成沉淀，但是口服后在胃液和肠液的作用下均能被分解而发挥药效作用。陈哲杰等[13]也发现三黄泻心汤中黄连与黄芩共煎产生的“絮状物”是其药效物质基础不可或缺的一部分，因为絮状物进入胃肠以后可以缓慢释放而发挥疗效。黄连、黄芩、白芍一起煎煮之后产生沉淀，药液在60℃以上阿胶烊化，50℃以下加入鸡子黄后搅拌，阿胶和鸡子黄的加入使药液形成一种较为稳定、均匀的混合体系，可以避免因为患者服药时沉淀物的丢弃而使疗效降低。考虑到以上因素，鸡子黄或许在增强抗焦虑作用的同时在汤剂中起到一定助悬剂的作用。

参考文献

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（收稿日期：2018-03-14 编辑：陶希睿）