合欢皮对小鼠焦虑行为影响及抗焦虑活性部位筛选

熊永豪 冯波 牛源菲 崔瑛 王君明 王红丽 管俊

摘要 目的：研究合欢皮对小鼠焦虑行为的影响，并对其活性部位进行初步筛选。方法：采用高架十字迷宫、明暗箱实验对合欢皮水提液、醇提液及各萃取部位进行抗焦虑研究；采用酶联免疫法检测脑内γ-氨基丁酸（GABA）、谷氨酸（Glu）和5-羟色胺（5-HT）含量。结果：高架十字迷宫、明暗箱实验显示，合欢皮水提液各剂量组具有明显的抗焦虑作用（P<0.05），合欢皮醇提液有较弱的抗焦虑作用。合欢皮水提液正丁醇萃取组及合欢皮醇提液正丁醇萃取组具有明显的抗焦虑作用（P<0.05）；酶联免疫实验结果显示，合欢皮水提液、合欢皮水提液正丁醇萃取组及合欢皮醇提液正丁醇萃取组均能明显提高小鼠脑内GABA含量，降低小鼠脑内Glu含量，降低小鼠脑内5-HT含量。结论：合欢皮对小鼠具有显著的抗焦虑作用；其作用机制与提高小鼠脑内GABA含量，降低小鼠脑内Glu和5-HT含量含量有关；其发挥抗焦虑作用的活性部位主要为正丁醇部位。

关键词 合欢皮；抗焦虑；高架十字迷宫；明暗箱；正丁醇部位

Abstract Objective：To study the anxiolytic effects of Cortex Albiziae on mice，and make a preliminary screening of its active site.Methods：We studied the anti-anxiety effect of water extraction of Albizia，alcohol extraction and various parts of Albizia extraction by the elevated plus maze，light-dark.The contents of GABA，Glu，5-HT in brain were detected by ELISA.Results：The results of elevated plus maze and light-dark experiments showed that each dose group of water extraction of Cortex Albiziae had a significant anxiolytic effect （P<0.05），and each dose group of Cortex Albiziae alcohol extract didn′t show a significant anxiolytic effect （P>0.05）.Cortex Albiziae water extract butanol group and Cortex Albiziae alcohol extract butanol group had clearly anxiolytic effect （P<0.05）； ELISA results showed that water extract of Cortex Albiziae，Cortex Albiziae extract butanol group and Cortex Albiziae alcohol butanol extract could significantly increase the content of GABA in mice，reduce Glu and 5-HT content in brain.Conclusion：Cortex Albiziae has a significant anxiolytic effect on mice.And this mechanism is related with its effects of improving GABA content and reducing Glu and 5-HT content in the brain of mice.The anxiolytic activity site of Cortex Albiziae is the n-butanol fraction.

Key Words Cortex Albiziae； Anxiolytic； Elevated plus maze； Light-dark； N-butanol fraction

中圖分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.04.002

焦虑症（Anxiety）又称焦虑性障碍，是一种以焦虑情绪为主要表现的神经症，是以广泛和持续发作性焦虑或反复发作性惊恐不安为主要特征的神经性障碍，临床上常伴有头晕、呼吸困难、心悸、汗出、胸闷、口干、尿急、尿频和运动不安等[1-5]，随着工作生活压力的增大，其发病率逐年上升。西医治疗焦虑症存在着广泛的不良反应，如头昏、嗜睡、乏力及记忆力减退等[6]，而且容易产生药物依赖性以及停用药物后一系列戒断症状[7]，单纯的心理治疗治愈率也并不高。因此研究开发安全有效的抗焦虑中药制剂显得尤为重要[8]。

合欢皮为豆科植物合欢Albizia julibrissin Durazz.的树皮，始载于《神农本草经》，性平味甘，归心、肝、肺经。2015版《中华人民共和国药典》记载了合欢皮具有解郁安神、活血消肿的功效，临床常用于心神不安、忧郁失眠、肺痈、疮肿、跌扑伤痛等病症[9]。药理研究表明合欢皮一般剂量（10～15 g）可解郁安神，起镇静作用[10]，中低剂量合欢皮水煎液可协同戊巴比妥纳缩短睡眠潜伏期及延长睡眠时间（P<0.01），起镇静催眠作用[11]。且已有研究表明合欢皮提取物具有一定的抗焦虑作用[12]。本实验通过观察合欢皮对焦虑小鼠行为的影响，评价合欢皮的抗焦虑药效作用并探讨其作用机制，并对合欢皮抗焦虑作用的活性部位进行初步筛选，以便为临床辨证用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 KM小鼠，SPF级，体重（20±2）g，雄性。购自郑州大学医学院动物实验中心，许可证号：SCXK（豫）2010-0002，质量证号：NO.41003100000236。分笼饲养于动物实验中心，温度（20±2）℃。

1.1.2 药物 地西泮片（天津力生制药股份有限公司，批号：1304006）；合欢皮（郑州市瑞龙制药股份有限公司，批号：141202）。

1.1.3 试剂与仪器 氯仿（天津市登科化学试剂有限公司，AR）；乙酸乙酯（天津市登科化学试剂有限公司，AR）；正丁醇（天津市登科化学试剂有限公司，AR）；乙醇（天津市登科化学试剂有限公司，AR）等；γ-氨基丁酸（GABA）检测试剂盒（R&D，批号：20131101A）；谷氨酸（Glu）检测试剂盒（R&D，批号：20131101A）；五羟色胺（5-HT）检测试剂盒（R&D，批号：20131101A）；PM-100高架十字迷宫视频分析系统（成都泰盟科技有限公司）、小鼠明暗箱装置（实验室自制）、酶免仪（680 Microplate Reader，Bio-Rad Laboratories）等。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 在合欢皮水提液和醇提液对小鼠抗焦虑作用研究中，选用雄性SPF级小鼠，60只，体重（20±2）g，适应性饲养3 d，第4天称重编号，按随机分组软件随机分为5组，每组12只，分别为焦虑模型组，阳性给药组，合欢皮水提液高、中，低剂量组；在合欢皮对小鼠抗焦虑活性部位筛选的研究中，选用雄性SPF级小鼠，100只，体重（20±2）g，适应性饲养3 d，第4天称重编号，按随机分组软件随机分为10组，10只/组，分别为焦虑模型组，阳性组，地西泮水溶液组，合欢皮水提液组，合欢皮水提液氯仿萃取物组，合欢皮水提液乙酸乙酯萃取物组，合欢皮水提液正丁醇萃取物组，合欢皮醇提物组，合欢皮醇提物氯仿萃取组，合欢皮醇提物乙酸乙酯萃取组，合欢皮醇提物正丁醇萃取组。

以上实验，均选用高架十字迷宫（EPM）和明暗箱（LDT）来制备装置环境所致的焦虑动物模型。

1.2.2 给药方法

1.2.2.1 药物的制备 取合欢皮（粗粉）50 g，水提2次，1 h/次，趁热过滤，合并滤液，减压浓缩至100 mL，将浓缩液平均分为2份，1份作为合欢皮水提物供药理实验，另一份依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，所得萃取液减压浓缩至浸膏，各加水50 mL得合欢皮水提物的氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物药液，备用；另取合欢皮（粗粉）50 g用95%乙醇回流提取2次，1 h/次，趁热过滤，合并滤液，减压浓缩至浸膏并揮至无醇味，取干燥浸膏分成2份，分别加水50 mL，1份作为合欢皮醇提液，另1份依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，所得萃取液减压浓缩至浸膏，各加水50 mL得合欢皮醇提物的氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物药液，备用。

1.2.2.2 合欢皮水提液对小鼠的抗焦虑作用研究于每日上午8：30灌胃给药，给药体积0.1 mL/10 g，连续给药5 d。焦虑模型组给予蒸馏水；阳性组给予地西泮水溶液（2.5 mg/kg）；合欢皮水提液高、中、低剂量组分别给予（5 g/kg，2.5 g/kg，1.25 g/kg）的合欢皮水提液。

1.2.2.3 合欢皮醇提液对小鼠的抗焦虑作用研究于每日上午8：30灌胃给药，给药体积0.1 mL/10 g，连续给药5 d。焦虑模型组给予蒸馏水；阳性组给予地西泮水溶液（2.5 mg/kg）；合欢皮醇提液高、中、低剂量组分别给予（0.0633 g/kg，0.0315 g/kg，0.0153 g/kg）的合欢皮醇提液。

1.2.2.4 合欢皮对小鼠抗焦虑活性部位筛选 于每日上午8：30灌胃给药，给药体积0.1 mL/10 g，连续给药5 d。焦虑模型组给予蒸馏水；阳性组给予地西泮水溶液（2.5 mg/kg）；合欢皮水提液组给予合欢皮水提液（2.5 g/kg）；合欢皮水提液氯仿萃取物组给予合欢皮水提液氯仿萃取物（0.024 g/kg）；合欢皮水提液乙酸乙酯萃取物组给予合欢皮水提液乙酸乙酯萃取物（0.025 g/kg）；合欢皮水提液正丁醇萃取物组给予合欢皮水提液正丁醇萃取物（0.11 g/kg）；合欢皮醇提物组给予合欢皮醇提物（0.0315 g/kg）；合欢皮醇提物氯仿萃取组给予合欢皮醇提物氯仿萃取物（0.017 g/kg）；合欢皮醇提物乙酸乙酯萃取组给予合欢皮醇提物乙酸乙酯萃取物（0.084 g/kg）；合欢皮醇提物正丁醇萃取组给予合欢皮醇提物正丁醇萃取物（0.16 g/kg）。

1.2.3 检测指标与方法 本实验选用高架十字迷宫试验中的开臂进入次数百分比和开臂滞留时间百分比以及明暗箱实验中的穿箱次数作为评价药物抗焦虑作用的指标；并用酶联免疫吸附法对小鼠脑组织中GABA、Glu和5-HT的含量进行测定，以探讨其抗焦虑作用的机制。具体方法如下。

1.2.3.1 高架十字迷宫实验 灌胃给药第5天，按日常灌胃顺序，每5 min间隔给药，给药0.5 h后进行高架十字迷宫实验。实验前先将小鼠置于开场中活动5 min，然后将小鼠置于迷宫中央，使其头部正对其中一个开放臂，用计算机跟踪记录小鼠在高架十字迷宫上的活动情况，记录时间为5 min。以小鼠开臂进入次数百分比（OE%）即开臂进入次数/（开臂进入次数+封臂进入次数）和开臂滞留时间百分比（OT%）即开臂滞留时间/（开臂滞留时间+封臂滞留时间）作为评价药物抗焦虑作用的指标[13]。

1.2.3.2 明暗箱实验 高架十字迷宫实验结束后立即进行明暗箱实验，先使其在安静的环境下自由活动5 min，然后将小鼠背对暗室置于明室中央，观察记录10 min内小鼠在明暗箱内的穿箱次数（TT），以此作为评价药物抗焦虑作用的指标。实验过程中注意保持实验环境的安静和实验装置的清洁从而减少外界环境对实验结果的影响[14]。

1.2.3.3 抗焦虑作用机制研究 小鼠行为学实验结束后，立即断头处死，冰台上迅速剥离全脑，用万分之一天平精密称重，以脑组织（g）：生理盐水（mL）=1∶4的比例加入冰冷的生理盐水，低温下用超声波细胞粉碎机进行匀浆，匀浆液在4 ℃，8 000 r/min条件下离心10 min，取上清液置5 mL离心管中，即得浓度为20%的小鼠脑匀浆液，取脑匀浆液进行酶联免疫吸附法，分别测定脑组织中GABA、Glu和5-HT的含量[15]，具体操作严格按照试剂盒说明进行。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0软件对实验结果进行单因素方差分析，组间采用LSD检验，最终结果以（±s）表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 合欢皮水提液对小鼠焦虑行为的影响 与焦虑模型组比较，阳性对照组地西泮能增加小鼠高架十字迷宫OE%值（P<0.05）和OT%值（P<0.05），明显增加小鼠在明暗箱穿箱TT值（P<0.01），表明造模成功。与焦虑模型组比较，合欢皮水提液高剂量组能增加小鼠高架十字迷宫OT%值（P<0.05）；合欢皮水提液中剂量组能显著增加小鼠高架十字迷宫OT%值（P<0.01）和OE%值（P<0.05）；合欢皮水提液各剂量组均能增加小鼠在明暗箱TT值（P<0.05）。显示出合欢皮中、高剂量水提液对小鼠的抗焦虑作用，尤其以合欢皮水提液中剂量的抗焦虑作用更为明显。见表1。

2.2 合欢皮醇提液对小鼠焦虑行为的影响 与焦虑模型组比较，阳性对照地西泮组小鼠高架十字迷宫OE%值和OT%值均有显著性增加（P<0.05），说明焦虑模型造模成功。与焦虑模型组比较，合欢皮醇提液仅中剂量组能增加小鼠高架十字迷宫OE%值（P<0.05），其余各组在小鼠高架十字迷宫OE%值开、OT%值，及穿箱TT值上均仅显示出有一定的趋势，差异无统计学意义。见表2。

2.3 合欢皮不同部位对焦虑小鼠行为影响

与焦虑模型组比较，阳性对照地西泮组能显著增加小鼠高架十字迷宫OE%值和OT%值，表明焦虑模型造模成功。

与焦虑模型组比较，合欢皮水提液组、水提乙酸乙酯组、水提正丁醇组、合欢皮醇提物组、合欢皮醇提物正丁醇萃取物组均有显著性提高小鼠高架十字迷宫OT%值（P<0.05）；水提氯仿萃取组、醇提氯仿萃取组、醇提乙酸乙酯萃取组差异无统计学意义（P>0.05）。

与焦虑模型组比较，合欢皮水提液组、合欢皮水提正丁醇萃取组、合欢皮醇提正丁醇萃取组均有显著性提高小鼠高架十字迷宫OE%值（P<0.05）；水提氯仿萃取组、水提乙酸乙酯萃取组、合欢皮醇提物组、醇提氯仿萃取组、醇提乙酸乙酯萃取组差异无统计学意义（P>0.05）。

与焦虑模型组比较，仅阳性对照地西泮组能显著提高穿箱TT值（P<0.05）。

上述结果提示，合欢皮水提液组、合欢皮水提正丁醇萃取组、合欢皮醇提正丁醇组有一定的抗焦虑作用。见表3。

2.4 合欢皮对焦虑小鼠脑内GABA、Glu、5-HT含量的影响 与焦虑模型组比较，阳性对照地西泮组、合欢皮水提液组、合欢皮水提正丁醇部位、合欢皮醇提正丁醇部位均可提高小鼠脑内GABA含量，降低小鼠脑内Glu含量，降低小鼠脑内5-HT含量，其抗焦虑作用机制可能与其降低小鼠脑内Glu、5-HT含量，提高小鼠脑内GABA含量有关。见表4。

3 讨论

实验结果表明合欢皮水提液（2.5 g/kg）对焦虑小鼠行为有明显的干预作用，即合欢皮水提液（2.5 g/kg）有一定的抗焦虑作用。合欢皮的醇提液经过多次调整剂量及多次抗焦虑小鼠行为学实验，仅合欢皮醇提液（0.0315 g/kg）表现出较弱的抗焦虑作用。表明合欢皮抗焦虑有效部位主要在水溶性部位。将合欢皮水提液和醇提物分别经氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将萃取物分别进行抗焦虑行为学实验，发现合欢皮水提液正丁醇萃取物及合欢皮醇提物正丁醇萃取物均有较好的抗焦虑作用，即合欢皮抗焦虑的有效部位主要为正丁醇部位。通过对小鼠脑内递质含量的测定，发现其抗焦虑作用与提高小鼠脑内GABA含量，降低小鼠脑内Glu、5-HT含量有关。合欢皮的正丁醇部位主要为木酯素类物质，有报道表明其木酯素类成分为合欢皮镇静安神的主要成分[16]，这与我们的实验结果相契合。由此我们可以在已经证明正丁醇部位为有效活性部位的基础上进行进一步的研究，在分离得到的正丁醇部位可以采用硅胶色谱法将其分离，在分离得到的物质上继续进行抗焦虑行为学实验，以便进一步明确合欢皮抗焦虑的活性成分。

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