多时间点观察电针“委中”对大鼠腰多裂肌损伤后IGF1R和IGFBP3的表达

卢宗孝 晏珺 于雪 陈冬荔 邹德辉 陈玉佩 许玥 张佳怡 白玉琢 张莉 霍则军

摘要 目的：研究多时间点电针“委中”穴对大鼠腰多裂肌损伤后1型胰岛素样生长因子受体（IGF1R）和胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）的表达。方法：选取90只雄性SD大鼠并将其随机分成空白组、模型组、电针委中组，每组30只，模型组和电针委中组腹腔麻醉后往双侧L4-5多裂肌注射0.5%布比卡因溶液制造多裂肌损伤模型，空白组不做处理，造模后电针委中组行1次/d电针委中穴治疗，3组分别于治疗后1 d、2 d、3 d、7 d、14 d后同步取材，通过Western Blotting法观察多裂肌中IGF1R、IGFBP3的表达动态变化。结果：治疗后2 d、3 d、7 d、14 d模型组IGF1R的表达高于空白组（P<0.05）；治疗后1 d、2 d电针委中组IGF1R的表达高于模型组（P<0.05）。治疗后7 d、14 d模型组IGFBP3表达高于空白组；治疗后2 d、14 d电针委中组IGFBP3表达低于模型组。结论：电针委中穴可在早期增加IGF1R的表达，并下调IGFBP3的表达，促进多裂肌损伤后的修复。

关键词 多裂肌；电针；委中；1型胰岛素样生长因子受体；胰岛素样生长因子结合蛋白3

Abstract Objective：To observe the effects of electro-acupuncture at BL 40 on the expression of the type 1 IGF receptor （IGF1R） and IGF binding protein 3 （IGFBP3） in rats with multifidus muscle injury.Methods：A total of 90 male Sprague Dawley rats were randomly divided into blank group （BG），model group （MG） and BL 40 electro acupuncture group （WG），with 30 rats in each group.Then the rats in MG and WG were injected with 0.5% bupivacaine into both sides of L4-5 multifidus muscle.After model establishment，the rats in WG accepted electro-acupuncture once a day.The changes of IGF1R and IGFBP3 in 3 groups′ multifidus muscle were observed and analyzed at 1st，2nd，3rd，7th and 14th day.Results：The expression of IGF1R at day 2，3，7，14 was higher than BG （P<0.05），while WG was higher than MG at day 1 and day 2.The MG′s expression of IGFBP3 was higher than BG′s at day 7 and day 14.Compared with MG，the expression of IGFBP3 in WG decreased at day 2 and day 14.Conclusion：Electro-acupuncture at BL 40 could increase the expression of IGF1R and decrease the expression of IGFBP3，so as to promote the regeneration of tissue after multifidus muscle injury.

Key Words Electro-acupuncture； Multifidus muscle； BL 40； Type 1 IGF receptor； IGF binding protein 3

中圖分类号：R245；R287.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.04.040

2017年美国医师学会（ACP）发表的《急性、亚急性及慢性腰痛的无创治疗临床实践指南》中，针灸等多种非药物治疗被推荐为一线疗法，其中针灸是唯一被推荐的急性与慢性腰痛治疗均可选用的一线疗法[1]。在疗效认可的同时，非常有必要进一步挖掘针灸治疗腰痛的作用机制。

多裂肌位于脊柱最内侧，能参与脊柱的背伸运动，保证椎体的紧密连接，分配所受压力，其在腰部比较发达，对维持腰椎的稳定性尤为重要，而腰部多裂肌损伤或功能紊乱可导致各种急慢性腰痛[2-3]，因此，促进腰多裂肌的修复和功能重建对治疗腰痛有重要的作用[4]。胰岛素样生长因子1（IGF1）是能有效促进骨骼肌的损伤修复。前期实验证明，电针委中穴可以促进布比卡因引起的腰多裂肌损伤后的再生修复，同时伴随IGF1的高表达，因此考虑针刺促进骨骼肌再生修复与IGF1的高表达相关。IGF1是通过与其受体IGF1R发挥其生物学作用的，而胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）则是可以调节IGF1生物活性的重要蛋白。因此，本实验拟以布比卡因致大鼠腰部多裂肌损伤为模型，设置多个时间点动态观察电针委中穴对模型大鼠腰多裂肌IGF1R及IGFBP3表达的时间规律，探讨针刺促进骨骼肌再生修复的作用靶点和部分作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级健康成年雄性SD大鼠90只，体重290～320 g。由北京维通利华实验动物中心提供，许可证号：SCXK（京）2012-0001。随机分笼饲养，明暗周期12 h，自由饮食和饮水，环境温度24 ℃，湿度40%～50%，适应性饲养7 d。

1.1.2 试剂与仪器

主要仪器：半自动化石蜡切片机（RM2245，德国莱卡仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（黄石市恒丰医疗器械有限公司）；正置智能型显微镜及采集系统（BX53，奥林巴斯中国有限公司）；韩式电针仪（HANS200A，北京思盛达医疗器械中心）；蛋白质电泳及转膜系统（美国Bio-Rad公司）；FluorChem FC2凝胶成像系统（美国Alpha Innotech公司）。

主要试剂：布比卡因盐酸盐（美国sigma公司）；10%水合氯醛（北京欧北生物科技有限公司）；40%多聚甲醛溶液（北京兰博利德）；蛋白Marker（美国Thermo公司）；Glycine甘氨酸（美国VWR公司）；一抗稀释液（上海碧云天生物技术有限公司）；IGF1R兔抗体（Abcam公司）；IGFBP3（美国Proteintech公司）；GAPDH鼠抗体（美国Proteintech公司）；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；ECL发光液（英国GE Healthcare公司）；PVDF膜（美国MLIPLE公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組与模型制备

分组采用完全随机方法将大鼠分成空白组、模型组和电针委中组，每组30只，各组再随机分成5个时间点（治疗1 d、2 d、3 d、7 d、14 d），每个时间点6只。

造模采用一次性局部肌内注射布比卡因建立大鼠多裂肌的损伤模型。造模前，10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔麻醉，背部备皮，操作过程保持无菌。选择双侧脊柱L4、L5水平两旁的4个点，使用一次性4号针头注射器抽取0.5%布比卡因溶液，针头紧贴棘突旁进入肌肉，直到接触关节突和乳突所在的骨面回抽套管1 mm无血，表明针头已到达多裂肌，后注射布比卡因溶液400 μL（100 μL×4），时间不得<3 s，以利于药物的吸收[5]。

1.2.2 干预方法 电针委中组从造模后第1 d开始电针“委中”穴干预，将大鼠固定在操作台上，暴露双后肢。采用华佗牌0.30 mm×13 mm一次性针灸针，直刺3 mm，针刺后连接韩式电针仪HANS-100B，电针仪负极接大鼠左侧委中穴，正极接大鼠右侧委中穴，2/100 Hz的疏密波，电流1 mA，持续20 min，1次/d，治疗持续至取材前1 d。参照《实验针灸学》[6]常用实验动物穴位图谱，选取双侧“委中穴”（膝关节背面正中）。模型组与电针委中组同步抓取、固定，不做其他处理。空白组不做任何治疗。3组在治疗后1 d、2 d、3 d、7 d、14 d同步取材（每组各6只）。

1.2.3 检测指标与方法

HE染色观察腰多裂肌横断面形态学变化：使用4%多聚甲醛溶液固定腰多裂肌48 h以上，常规梯度乙醇脱水，石蜡包埋，连续切片，再对切片进行二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，苏木精伊红（HE）染色，自来水冲洗，盐酸乙醇分化，自来水冲洗，伊红液染色，透明，封固。最后在光镜下观察腰多裂肌横断面形态学变化。

Western Blotting法测定IGF1R、IGFBP3含量：取-80 ℃冰箱的多裂肌组织，加入RIPA裂解液低温匀浆后取上清液，后加入5×上样缓冲液，沸水煮样后冰中迅速降温。将提前制好的10%丙烯酰胺凝胶置于电泳槽中，100 V电泳（Marker上样5 μL，其余10 μL上样），再75 V电转75 min。摇床封闭90 min，TBST洗膜10 min，按Marker剪膜，加入一抗（IGF1R按1∶1 000稀释；IGFBP3按1∶500稀释；GAPDH按1∶10 000稀释）室温孵育60 min，TBST洗5次各5 min，加入二抗（1∶5 000稀释），TBST洗5次各5 min，ECL显色并曝光，最后得到的X线片采用FC2（Alpha Innotech Fluor Chem）凝胶成像系统采集图像，并定量分析IGF1R、IGFBP3的吸光度（A），取各指标与GAPDH的吸光度比值进行统计分析。

1.3 统计学方法 数据采用SPSS 20.0统计软件对所得数据进行分析，每组样本数据用均数±标准差（±s）表示，用单因素方差分析，2组间比较采用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 腰多裂肌横断面组织形态学变化 空白组肌细胞大小均匀，肌间隙均匀，排列整齐，细胞核均匀排布于肌细胞边缘；治疗1 d，模型组与电针委中组均出现肌间隙增大，并有大量炎性细胞浸润，但模型组肌细胞大小不均，部分甚至破裂，而电针委中组肌细胞大小尚均匀，少有破裂；治疗3 d，模型组与电针委中组均可见较多新生的中央核纤维生成，但模型组仍可见较多炎性细胞浸润，而电针委中组的炎性细胞较少；治疗7 d，模型组可见炎性细胞与大量新生的中央核纤维，而电针委中组较多的新生肌纤维的细胞核已经迁移到细胞边缘并恢复大小，呈现规则的多边形。见图1。

2.2 Western blotting测量IGF1R、IGFBP3的表达

2.2.1 3组大鼠腰多裂肌IGF1R表达比较 治疗1 d后，模型组与空白组大鼠腰多裂肌IGF1R表达比较，差异无统计学意义（P>0.05），电针委中组的表达高于空白组和模型组（P<0.05）；治疗2 d后，模型组高于空白组（P<0.05），电针委中组的表达高于空白组和模型组（P<0.05）；治疗后第3 d、7 d、14 d，模型组与电针委中组的IGF1R的表达均高于空白组（P<0.05），电针委中组IGF1R表达与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2.2 3组大鼠腰多裂肌IGFBP3表达比较 治疗1 d后，3组大鼠腰多裂肌IGFBP3表达比较，差异无统计学意义（P>0.05），但电针委中组的表达量已有下降趋势；治疗2 d后，模型组与空白组比较，差异无统计学意义（P>0.05），电针委中组的表达量低于空白组与模型组（P<0.05）；治疗7 d后，模型组的表达量高于空白组（P<0.05）；治疗14 d后，模型组的表达量高于空白组（P<0.05），而电针委中组的表达量低于模型组（P<0.05）。见表2和图2～4。

3 讨论

我国每年有约22%的人承受腰痛的折磨[7]，而腰痛患者常常伴随多裂肌的萎縮及脂肪浸润[8]，故促进多裂肌的损伤修复对治疗腰痛有重要作用。《四总穴歌》记“腰背委中求”，委中穴为足太阳膀胱经合穴与下合穴，体现了“经脉所过，主治所及”的治疗思路，是治疗腰痛的宝贵临床经验总结。故本实验从委中穴与多裂肌的损伤修复为着眼点探求其作用机制。

IGFs系统包括生长因子，受体与结合蛋白，为探索不同时期IGF1R与IGFBP3的表达规律，本实验设置了多个时间点。其中IGF1是骨骼肌损伤修复过程中重要的生长因子。骨骼肌损伤后，炎性细胞除释放炎性因子外[9]，亦可表达IGF1，另外损伤的骨骼肌自身亦可以表达IGF1。IGF1能促进细胞增殖分化，并抑制凋亡[10-11]，从而促进骨骼肌再生。肖卫华等[12]观察了小鼠腓肠肌钝挫伤后1 d、3 d、7 d、14 d 4个时间点IGF1mRNA的变化，发现IGF1 mRNA在损伤后第1天开始已经显著增加，并于第3天达到峰值，说明在骨骼肌损伤的较早期，IGF1已经大量分泌。方忆生等[11]用电针委中穴治疗大鼠腰顿挫伤14 d，委中组的IGF1的表达显著高于模型组。以上都说明了电针委中穴可以提高IGF1在多裂肌损伤修复过程中的表达。

IGF1R是IGF1发挥作用的关键蛋白，IGF1只有与IGF1R结合后，激活MEK/ERK1/2等信号通路才可促进肌纤维的再生和修复[13-14]。诱导基因敲除IGF1R的小鼠其肌肉的再生会受到严重影响[15]。本实验在治疗1 d与2 d后，电针委中组的IGF1R表达显著高于模型组，这明确了IGF1在多裂肌损伤修复过程中的重要作用。但随着时间增加（治疗3 d后），电针委中组IGF1R的表达维持在同一高水平，模型组的IGF1R的表达逐步上升，电针委中组IGF1R虽高于模型组，但无明显差异。这说明电针委中治疗能在多裂肌损伤早期提升IGF1R的表达，或者说是电针委中穴能在时间上加速IGF1R的表达，使IGF1更快地发挥作用，加速了多裂肌的损伤修复的进程。

IGF1在细胞外液中能与特异性的结合蛋白结合。结合蛋白以IGFBP3为主，IGFBP3与IGF1的亲和力高于IGF1与其受体的亲和力，因此IGFBP3可以通过与IGF1R竞争结合IGF1，从而阻滞了IGF1与受体结合，进而抑制IGF1的活性发挥[16]。在本实验中，治疗2 d与14 d后，电针委中组的IGFBP3表达低于模型组，说明电针委中穴能下调IGFBP3的表达，从而增加IGF1的活性，有利于多裂肌的再生修复。

另外，在本实验中随着时间增加，模型组与电针委中组IGFBP3均呈现出了逐渐上升趋势。其中原因考虑与多裂肌损伤修复过程中IGF1的高表达相关。有研究表明，人血清中IGFBP3与IGF1的表达呈正相关，IGFBP3能够有效反映体内IGF1的总体水平[17]。张小辉等[18]研究发现，牛肌肉组织中IGFBP3与IGF1的表达均随着月龄的增加而降低，两者的表达趋势基本相同。

目前有研究表明，IGFBP3还存在非IGF1依赖途径，可以通过细胞膜上IGFBP3特异性受体独立发挥作用，阻断细胞增殖、促进细胞凋亡[19]。在本实验中，穴虽然能下调腰多裂肌中IGFBP3的表达，但是电针委中是否影响了IGFBP3的非IGF1依赖途径，尚有待研究。

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