尖叶假龙胆对酒精性肝损伤大鼠的保护作用

胡晓阳，蒋皓，邹尚亮，张双良

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.齐齐哈尔市中医医院，黑龙江 齐齐哈尔 161000；3.河北省沧州中西医结合医院，河北 沧州 061000)

酒精性肝损伤(Alcoholic Liver Disease,ALD)是指因过量饮酒导致的肝脏病理性损伤[1]。在组织病理学上主要表现为以下4种逐渐递进的形式：酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化，这4种损伤形式可单独或混合存在[2-3]。酒精性肝损伤发病机制相当复杂，因其涉及到酒精与其代谢产物对肝脏产生的直接或间接作用，同时酒精性肝损伤的发生、进展还与遗传易感性及营养状态密切关联。全世界有大约1 500万～2 000万人酗酒，这其中就有10%～20%的人发生酒精性肝损伤[4]。酒精性肝损伤是发达国家肝硬化的主要致病原因(占80%～90%)，也是导致青壮年死亡的主要原因[5]。近年随着中国居民生活水平的提高，嗜酒者逐渐增多，酒精性肝损伤的发生率呈逐年上升的趋势，酒精已成为继病毒性肝炎之后导致肝损伤的第二大病因[6-7]，因此对酒精性肝损伤的研究日渐引起人们的广泛关注。

尖叶假龙胆为龙胆科假龙胆属下的一个种，也叫苦龙胆，叶披针形，宽3～7 mm；花萼长7～10 mm，萼简短，花冠长9～12 mm，裂片具流苏状副冠。生于湿草地，产于黑龙江、内蒙古[8]。该药味苦，具有清热、利湿之功，主要在民族医学中的藏医、蒙医学中使用，用于治疗黄疸、肝炎、胆囊炎、头痛、发热等疾病，疗效显著。《蒙植药志》记载其为阿古特-其其格，并认为其全草可治黄疸，头痛，发热，口干，未成熟热，胆热，并有治疗黄疸型肝炎，胆囊炎，心绞痛，发烧，外伤感染的记载。鄂伦春族用以治疗心律失常等心脏病[9]。现代对于尖叶假龙胆的药效学研究主要集中在保肝、抗心律失常、抗氧化、降糖、抗心肌纤维化等方面[10-11]。现代研究证实,尖叶假龙胆具有显著的抗氧化活性以及对某些代谢酶的调节作用，ALD发病主要是由氧化应激、某些基因的激活参与，因此尖叶假龙胆可能具有防治ALD的功效。

1 材料

1.1 阳性药液的制备

东宝甘泰片(吉林通化东宝药业股份有限公司,批号141203)粉碎后以蒸馏水将其稀释成0.04 g/ml的溶液，阳性药组大鼠给药量为10 ml/kg,相当于临床成人常用量的6.25倍。

1.2 尖叶假龙胆高、中、低浓度药液的制备

尖叶假龙胆全草采自黑龙江大兴安岭地区漠河县，由黑龙江中医药大学王振月教授鉴定为Gentianellaacuta的全草。尖叶假龙胆全草1 kg粉碎，以75%乙醇20 L浸泡于圆底烧瓶中2 h，加热回流提取、过滤2次，二次药液混合，于连接循环水真空泵的旋转蒸发器中减压浓缩，得尖叶假龙胆浸膏，待用。加蒸馏水稀释至2 L，相当于含生药材浓度为0.50 g/ml，此为高浓度；取出1 L加蒸馏水1 L，相当于0.25 g/ml,此为中浓度；取中浓度1 L，加蒸馏水1 L，相当于0.13 g/ml,此为低浓度。

1.3 实验动物

雄性Wistar大鼠60只，体质量180～220 g，由哈尔滨育英养殖场提供，许可证编号：SCXK(黑)2013-001。将小鼠置于室温，给予标准的实验室食物和充足的淡水。遵循国家制定的有关实验动物保护和使用的指南，并经本单位实验动物伦理委员会批准。

2 方法

2.1 大鼠酒精性肝损伤模型的建立及取材

本实验采用酒精灌胃法[1]建立大鼠酒精性肝损伤模型。将60只Wistar大鼠随机分为6组，每组10只，分别是空白组、模型组、阳性药组、高剂量组、中剂量组、低剂量组，适应性饲养1周后，除正常喂养外，模型组，阳性药组，高、中、低剂量组均给予梯度50%乙醇灌胃，即：第1周2 ml/kg,第2周4 ml/kg,第3周6 ml/kg,从第4周开始到第8周结束7 ml/kg；空白组给予等量生理盐水。第7～8周高、中、低剂量组分别给予相应浓度的尖叶假龙胆稀释液10 ml/kg,阳性药组给予东宝肝泰稀释液10 ml/kg,空白组、模型组给予生理盐水10 ml/kg。末日晚8时开始禁食水，20%乌拉坦溶液5 ml/kg腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血后4 ℃ 3 500 r/min离心10 min，分离血清；取出完整肝脏，生理盐水洗净，滤纸吸干后称重并做记录，计算肝脏指数。

肝脏指数(%)=肝重/体质量×100%

2.2 生化指标的测定

天冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，批号151231)；丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，批号152421)；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20151014)；谷胱甘肽(GSH)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20151021)。严格按照说明书操作。

2.3 统计学处理

采用SPSS19.0统计软件对数据进行处理，结果以均值±标准差表示，数据应用单因素方差分析以及Dunnett＇s检验，检验水准定为α=0.05，P≤0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 尖叶假龙胆对酒精性肝损伤大鼠肝脏指数的影响

与空白组相比，模型组肝指数明显升高(P<0.05)，差异显著；与模型组相比，阳性药组、高剂量组、中剂量组、低剂量组肝脏指数均降低(P<0.05),差异均显著；与阳性药组比较，高剂量组、低剂量组肝指数均降低(P<0.05)，差异显著，中剂量组肝指数变化不明显(P>0.05)，结果见表1。

3.2 尖叶假龙胆对慢性酒精性肝损伤大鼠血清AST、ALT的影响

与空白组相比，模型组大鼠血清ALT浓度明显升高(P<0.01)，差异极显著；与模型组相比，阳性药组、高剂量组、中剂量组、低剂量组大鼠血清ALT浓度均降低(P<0.05)，差异显著；与阳性药组相比，高、中、低剂量组ALT浓度均降低(P<0.05)，差异显著；与高剂量组相比，中剂量组ALT浓度降低(P<0.05)，差异显著，低剂量组变化不明显(P>0.05)。

与空白组相比，模型组大鼠血清AST浓度明显升高(P<0.01)，差异极显著；与模型组相比，阳性药组、高剂量组、中剂量组、低剂量组AST浓度均明显降低(P<0.05)，差异显著；与阳性药相比，高剂量组AST浓度降低明显(P<0.01)，差异极显著，中剂量组、低剂量组降低明(P<0.05)，差异显著；与高剂量组相比，中剂量组AST浓度升高明显(P<0.05)，低剂量组AST浓度降低明显(P<0.05)，结果见表2。

表1 尖叶假龙胆对酒精性肝损伤大鼠肝脏 指数的影响

注：与空白组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05；与阳性药组相比，ΔP<0.05

表2 尖叶假龙胆对酒精性肝损伤大鼠血清AST、 ALT含量的影响

注：与空白组相比，**P<0.01；与模型组相比，ΔP<0.05；与阳性药相比，#P<0.05，##P<0.01；与高剂量组相比，☆P<0.05，☆☆P<0.01

3.3 尖叶假龙胆对酒精性肝损伤大鼠肝组织SOD、GSH含量的影响

与空白组相比，模型组SOD活力浓度明显降低(P<0.01)，差异极显著；与模型组相比，尖叶假龙胆中剂量组SOD活力浓度明显升高(P<0.01)，差异显著，阳性药组、高剂量组、低剂量组变化不明显(P>0.05)，差异无统计学意义。

与空白组相比，模型组GSH含量明显降低(P<0.01)，差异极明显；与模型组相比，尖叶假龙胆高剂量组GSH含量明显升高(P<0.01)，差异极显著，中、低剂量分组变化不明显(P>0.05)；与尖叶假龙胆高剂量组相比，中、低剂量组GSH含量明显低(P<0.01，P<0.01)，差异极显著，结果见表3。

表3 尖叶假龙胆对酒精性肝损伤大鼠肝组织SOD、 GSH活力或含量的影响

注：与空白组相比，**P<0.01；与模型组相比，ΔΔP<0.01；与高剂量组相比，☆☆P<0.01

4 讨论

肝指数为肝脏湿重与大鼠体质量的比值，长期过量饮酒导致酒精性肝损伤时，肝细胞肿胀变大，显水样变。当肝脏发生脂质代谢紊乱后，肝细胞内出现脂肪的淤积，发生脂肪变，使肝脏体积进一步增大，重量增加；当肝细胞的微管受损伤后，分泌功能受到阻碍，使得分泌性蛋白滞留在细胞内，细胞发生气球样变，体积增加，重量也增加，肝指数升高[12]。从该实验结果中可以看出，酒精性肝损伤造模成功，高、中、低剂量组肝指数均较模型组降低，且差异明显，但尖叶假龙胆各剂量组之间无明显差异。实验结果证明：尖叶假龙胆能够对酒精性肝损伤大鼠肝脏起到保护作用。

转氨酶的异常升高是肝脏疾病的标志[13]，从各组大鼠肝损伤指标AST、ALT的活性可以看出尖叶假龙胆具有保肝作用，这两种酶都存在肝细胞内，正常情况下在血清中含量很少，当肝脏受到损害，肝细胞膜的通透性增加，大量的AST、ALT释放入血，引起血中这两种酶的浓度升高，AST主要分布于肝细胞线粒体内，因此除非肝细胞线粒体也受到损伤，否则血清中AST浓度不会升高太多，应用尖叶假龙胆的实验组大鼠血清中这两种酶的浓度明显低于模型组，证明尖叶假龙胆对于增加肝细胞膜的稳定性确有作用。ALT与AST主要分布在肝脏的肝细胞内，肝细胞坏死时ALT和AST就会升高。谷丙转氨酶主要存在于肝细胞浆内,细胞内ALT浓度高于血清中1 000～3 000倍,正常时血清的含量很低，当肝细胞受损后，肝细胞膜通透性增加，胞浆内的ALT、AST释放入血浆，使得血清ALT、AST的酶活性升高，只要有1%肝细胞受损，谷丙转氨酶活性即升高一倍，因此，谷丙转氨酶被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标,其升高的程度与肝细胞受损的程度相一致，因此是目前最常用的肝功能指标。与ALT不同的是，大约80% AST存在于肝细胞线粒体中[14]，因此，不同类型的肝损伤，ALT和AST升高的程度及其AST/ALT的比值是不一样的。急性肝炎和慢性肝炎的轻型，虽有肝细胞的损伤，肝细胞的线粒体仍保持完整，故释放入血的只有存在于肝细胞浆内的ALT，所以主要表现为ALT的升高。重型肝炎和慢性肝炎的中型和重型，肝细胞的线粒体也遭到了严重的破坏，AST从线粒体和胞浆内释出，因而表现出AST升高多于ALT。肝硬化和肝癌患者，肝细胞的破坏程度更加严重，线粒体也受到了严重的破坏，因此，AST升高明显多于AST。酒精性肝病的患者，AST的活性也常常大于ALT。各实验组ALT活性均降低，说明尖叶假龙胆对肝脏有保护作用，但中、低剂量组效果明显强于高剂量组；对于AST活性的影响，各实验组均有降低作用，说明对肝脏具有保护作用，但低剂量组效果最明显。

一定浓度的尖叶假龙胆提取液能够提升酒精性肝损伤大鼠肝组织中SOD活力以及GSH含量，从而对肝脏具有保护作用。SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，能够清除超氧阴离子自由基,保护细胞免受损伤[15]。人们认为自由基(也称游离基)与绝大部分疾病以及机体的衰老有关。由于自由基非常活泼，化学反应性极强，参与一系列的连锁反应，能引起细胞生物膜上的脂质过氧化，破坏了膜的结构和功能。并且能引起蛋白质变性和交联，使体内的许多酶及激素失去生物活性，机体的免疫能力、神经反射能力、运动能力等系统活力降低，同时还能破坏核酸结构和导致整个机体代谢失常等，最终使机体发生病变。因此，自由基作为机体垃圾，能够促使某些疾病的发生和机体的衰老。虽然自由基会对机体产生诸多危害，但是在一般的条件下机体细胞内也存在着清除自由基、抑制自由基反应的体系，有的属于抗氧化酶类，有的属于抗氧化剂。SOD就是一种主要的抗氧化酶，能清除超氧化物自由基，在防御氧的毒性、抑制老年疾病以及预防衰老等方面起着重要作用。SOD能专一地清除体内有害的自由基，以解除自由基氧化体内的某些组成成分而造成的机体损害。GSH是一种低分子清除剂，它可清除O2、H2O2、LOOH(过氧化脂)。GSH是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种三肽，是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物，并且是GSH-Px和GST两种酶类的底物，为这二种酶分解氢过氧化物所必需，能稳定含巯基的酶和防止血红蛋白及其他辅因子受氧化损伤，GSH量的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。酒精性肝损伤进展过程中,会产生大量的氧自由基，氧自由基会对机体造成氧化损伤，同时大量的氧自由基作用于脂质，使其发生氧化反应最终生成MDA,后者会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，对细胞具有毒性作用，会加剧膜的损伤。实验组大鼠应用尖叶假龙胆后抗氧化损伤能力明显增强，肝组织中SOD水平明显升高，高剂量组血清中GSH含量也上升明显，这些改变均有助于减轻大鼠因饮酒导致的肝脏氧化损伤。

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